蒙古族ATP结合盒转运子A1基因R219K多态性与冠心病的相关性

袁托亚,王 丽,胡 刚,王悦喜,季英敏,王春燕,于赛华,海 荣

冠心病是危害人类健康的第二杀手,我国的发病率虽不及欧美各国,但也有逐年增高趋势。研究表明,腺苷三磷酸结合盒转运体(ABCA1)基因突变将导致细胞内胆固醇外流障碍,血浆高密度脂蛋白(HDL-C)极度降低,易早发冠心病。应用聚合酶链反应-限制片段长度多态性方法(polymerase chain reactionrestriction fragments length polymorphism,PCR-RFLP)分析内蒙古地区蒙古族人群和蒙古族冠心病人群中R219K多态性的发生率,现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 共观察内蒙古地区蒙古族115例,其中男67例,女48例,年龄57.1岁±11.0岁。所有观察对象之间没有血缘关系。冠心病组60例,冠状动脉造影确诊30例(至少1支冠状动脉直径狭窄≥50%),根据临床症状,结合心电图、超声心动图、心肌灌注ECT显像、64排冠状动脉CT确诊30例。对照组55例,经询问病史、体检、实验室检查(血、尿、便常规,血脂,血糖,肝、肾功能)、心电图、胸片、心脏彩超、心肌灌注 ECT显像、64排冠状动脉CT、冠状动脉造影等检查排除冠心病。通过问卷访谈收集研究对象的基本资料、高血压病病史、糖尿病病史、既往史、吸烟和饮酒史等。吸烟者的标准为每天吸烟10支以上。剔除标准:风湿性疾病、大动脉炎、梅毒、血液病、结核、肿瘤、严重肝肾功能不全等。

1.2 方法

1.2.1 血脂水平检测 所有化验检查均采用次日清晨空腹采取静脉血 3 mL,分离血清测定血脂水平,三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)以氧化酶法测定,低密度脂蛋白(LDL-C)用PEG变构酶法测定,试剂均为Leadman公司生产。仪器为日本OLYMPUS A U 600全自动生化分析仪。

1.2.2 DNA提取 用EDTA抗凝真空采血管采集外周静脉血3 mL,置于-80℃保存备用。按照血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒的说明提取血液DNA(由TIANGEN公司提供)。

1.2.3 设计引物 设计PCR引物,引物由Sangon公司合成,上游引物:5′GTA TTTT TGCTACCAGTTACATT TGACAA 3′,下游引物:5′GATTGGCTTCAGGATTGTTGGAA 3′。

1.2.4 ABCA1基因多态片段的PCR扩增 PCR反应在PTC-200型循环仪中进行。PCR反应体系50μ L,包括:2×Taq PCR MasterMix(由 TIANGEN 公司提供)25 μ L,DNA 2.0 μ L,上游和下游引物分别 1.0 μ L(10 μ M),灭菌超纯水 21 μ L。PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s、53℃退火30 s、72℃延伸40 s,共25个循环;72℃终末延伸5 min。

1.2.5 PCR产物的酶切消化 酶切反应体系30μL:PCR产物

10μL,XagⅠ内切酶(由 Fermantas公司提供)1.0 μ L,10×NEB Buffer 2.0μ L,灭菌超纯水 18.0 μ L,置于37 ℃酶切 12 h。取酶切产物在2%琼脂糖凝胶中电泳检测并确定样品基因型。DNA Marker为BioMarkerⅠ(由BioFluk公司提供)。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理,计量资料用均数±标准差(±s)表示,两组比较采用 t检验,两组以上比较采用one way ANOVA检验。基因型和等位基因与冠心病的相关性采用比数比(odds ratio,OR)及其95%的可信区间(confidence intervals,CI)来表示。计数资料的组间比较用卡方检验。

2 结 果

2.1 冠心病组与对照组一般资料比较 冠心病组与对照组在年龄分布上无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。常见冠心病危险因素如糖尿病史、吸烟史、男性率、HDL-C、LDL-C、TG,冠心病组明显高于对照组(P＜0.05),冠心病组高血压病史与对照组比较无统计学意义。

2.2 ABCA1基因R219K位点多态性分析 用PCR-RFLP方法测定发现,R219K扩增产物片段长度为177bp,经XagⅠ酶切后,K等位基因被切为107bp和70bp两个片段,而R等位基因由于无酶切位点仍为一个177bp的片段。这样出现三种大小片段,RR型:纯合子GG(177 bp);RK型:杂合子 GA型(177 bp,107 bp,70bp);KK型:纯合子AA(107bp,70bp)。详见图1。

图1 ABCA1基因 R219K多态性琼脂糖凝胶电泳结果

2.3 冠心病组与对照组等位基因片段频率分布 在对照组中,R和K两种等位基因片段的频率分别为48.2%和51.8%,而在冠心病组中分别为60.0%和40.0%。对冠心病组和对照组的基因型分布进行了平衡检验,χ2检验表明两种基因型的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,具有群体代表性。详见表1。

2.4 冠心病组与对照组间基因型和等位基因频率分布比较(见表1)冠心病组KK型分布明显低于对照组,差异有统计学意义。计算KK基因型的比数比OR值=0.411,95%CI(0.17～0.99),基因型KK个体显著减少患冠心病的危险。详见表1。

表1 两组ABCA1基因型和等位基因频率分布

3 讨 论

冠心病是一种复杂的多基因疾病,多种环境因素和遗传因素与冠心病的发病有关。临床流行病学研究表明,遗传因素在冠心病的发生、发展中起着至关重要的作用,从分子遗传学角度研究冠心病病因,可为冠心病的预防和治疗提供新的途径。

1999年人们阐明ABCA1基因变异与丹吉尔病(Tangier disease)、家族性 HDL-C缺乏的发生密切相关。ABCA1是ATP结合盒转运子(ATP binding cassette transporter,ABC)超家族的成员。人类ABCA1基因位于9q31,基因全长149kb。如果ABCA1基因突变,有可能使其编码的氨基酸改变,从而导致其功能发生改变,使胆固醇外流障碍[1],胆固醇和胆固醇酯在巨噬细胞内积聚而成为泡沫细胞,继而浸润血管壁,促进动脉粥样硬化和冠心病的发生发展。ABCA1基因是调节胆固醇和磷脂代谢平衡的关键途径,在动脉壁,增加ABCA1的表达可使巨噬细胞清除自身过多的胆固醇,从而发挥抗动脉粥样硬化的作用[2]。除此之外,有研究认为,ABCA1还参与动脉粥样硬化斑块进展中的程序性细胞死亡和炎症等病理过程[3]。

ABCA1基因R219K位点多态性分析,第7外显子第1051 bp位点鸟嘌呤(G)变成腺嘌呤(A),使翻译的蛋白质在219位点精氨酸(R)变成赖氨酸(K),故将其命名为 R219K多态性。目前,尚未见ABCA1基因的R219K多态性在内蒙古地区蒙古族人群中的相关报道。用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法测定发现,在蒙古族研究对象中,ABCA1基因存在RR、RK、KK三种基因型。冠心病组RK型基因频率和K等位基因频率低于对照组,但未达到统计学意义。冠心病组KK型基因频率明显低于对照组,差异有统计学意义,提示KK基因型是冠心病发病的一个保护因子,与文献报道一致[4]。初步研究表明同一ABCA1基因多态性在不同人种之间分布频率有明显差异。Singaraja等[5]报道K等位基因携带率在丹麦25.9%,南亚30.3%,加拿大oji-Cree人为37.8%,因纽特人为56.1%。而日本在327名小学生中做的研究显示,K等位基因携带率竟达到71%。长沙地区汉族携带率为43.6%[6],新疆维吾尔族人群携带率47.1%[7]。本研究结果为51.8%。这进一步说明不同种族人群基因多态性分布频率差别明显,相近种族间分布频率也有明显差别[8]。这种差异可能与样本的选择和ABCA1基因R219K多态性种族、族别以及生活饮食习惯和地域差异有关。

本结果提示,ABCAl基因R219K多态性与内蒙古地区蒙古族人群冠心病的遗传易感性相关,其中KK基因型可能是冠心病的保护因子。这种作用是否伴有血浆HDL-C水平的显著改变,今后尚需大样本的进一步研究证实。

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[5]Singaraja RR,Brunham LR,Visseher H,et al.Efflux and Atherosclerosis.The clinical and biochemical impact of variations in the A BCA1 gene[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2003,23:1322-1332.

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[7]王瑜,张向阳,徐新娟,等.新疆维吾尔族 ATP结合盒转运子A1基因R219K多态性与冠心病的关系[J].心血管康复医学杂志,2009,18(1):35-39.

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