斑蝥酸钠维生素B6注射液对人肺癌细胞系A549增殖抑制及核因子κB和Caspase3/7的影响

温省初，王一飞，李爱明，李冠军，成志勇，王亚丽，石 林

斑蝥酸钠维生素B6注射液对人肺癌细胞系A549增殖抑制及核因子κB和Caspase3/7的影响

温省初，王一飞，李爱明，李冠军，成志勇，王亚丽，石 林

目的 探讨斑蝥酸钠 (SC)维生素B6注射液对人非小细胞肺癌A549细胞增殖、凋亡及核因子κB(NF－κB)、凋亡分子Caspase3/7的影响。方法 用不同浓度 (0、1.0、2.5、5.0 mg/L)的SC维生素B6注射液处理A549细胞，观察光镜及Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡形态;用噻唑蓝 (MTT)比色法检测SC维生素B6注射液对细胞增殖的抑制作用;罗丹明123检测线粒体膜电位;Caspase3/7活性检测试剂盒检测Caspase3/7活性;蛋白印迹检测NF－κB P65、I－κB蛋白表达。结果 SC维生素B6注射液对A549细胞的体外增殖有明显抑制作用，细胞形态出现明显凋亡改变，5.0 mg/L组作用A549细胞72 h后，细胞增殖抑制率最大达到67.37%。细胞线粒体膜电位检测结果显示，随着SC维生素B6注射液浓度的增加及时间的延长，线粒体膜电位逐渐减弱，同时Caspase3/7蛋白活性增强;SC维生素B6注射液作用A549细胞后NF－κB P65蛋白表达水平显著降低 (P＜0.05)，而I－κB蛋白表达水平则无显著变化。结论 SC维生素B6注射液可能通过抑制NF－κB P65表达，激活Caspase－3/7活性，从而抑制A549细胞增殖，诱导细胞凋亡。

癌，非小细胞肺;斑蝥酸钠维生素B6;A549细胞系;膜电位，线粒体;Caspase3/7;NF－κB

肺癌是严重威胁人类生命和健康的主要恶性肿瘤之一，我国肺癌死亡率是所有肿瘤中上升最快的，成为我国居民的主要死因。肺癌的总体治疗效果差，5年生存率仅为5%～10%，近30年来无明显改善。大剂量高频率的化疗常导致患者不能耐受及出现各种不良化疗毒副作用［1］。

斑蝥素 (cantharidin，CTD)来源于传统中药斑蝥，临床多用于治疗中晚期恶性肿瘤［2－8］。斑蝥酸钠 (SC)为斑蝥酸衍生物，与CTD相比，其毒性低，能够明显改善晚期肿瘤患者的生存质量，是一种广谱抗肿瘤中药，同时具有免疫调节作用，能够促进自然杀伤细胞 (NK细胞)及浸润肿瘤淋巴细胞(TIL)的活性，并可刺激机体内巨噬细胞、淋巴细胞等产生白介素，增强抗肿瘤效果［7－8］。临床研究显示，SC单药或联合化疗对肝癌、胃癌、肺癌等多种恶性肿瘤均有明显疗效，并能够改善患者放化疗等不良反应，减轻化疗对白细胞的抑制作用［8］。SC维生素B6注射液是由SC和维生素B6配制的注射液，临床上应用于多种肿瘤的治疗，但其分子作用机制尚不清楚［8］。本研究通过观察不同剂量的SC维生素B6对人非小细胞肺癌A549细胞生长的影响，探讨SC维生素B6抑制肺癌细胞的可能的分子作用机制，为临床肺癌的综合治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SC维生素B6注射液 (艾易舒，贵州柏强制药有限公司生产)。噻唑蓝 (MTT)、碘化丙啶 (PI)、RNA酶、二甲基亚砜 (DMSO)及罗丹明123(北京鼎国生物技术有限公司生产);SYBR Green Real Master Mix［天根生化科技 (北京)有限公司］;Caspase－Glo 3/7 Assay试剂盒 (Promeg，USA);人非小细胞肺癌细胞系A549(协和医科大学血液病研究所)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A549细胞在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM 1640培养液中，37℃、5%二氧化碳 (CO2)、饱和湿度条件下培养。选取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 细胞形态学观察 收集终浓度为0、2.5 mg/L的SC维生素B6处理48 h的A549细胞，1×磷酸盐缓冲液 (PBS)洗涤2次，细胞离心，涂片后Wright染色，光镜下观察细胞形态变化。

1.2.3 Hoechst33342检测细胞凋亡 收集终浓度为0、5.0 mg/L的SC维生素B6处理48 h的A549细胞，1×PBS洗涤2次，加入荧光染料Hoechst33342至终浓度10.0 mg/L。常温避光染色15 min，取40 μl细胞悬液，在激发波长为350 nm荧光显微镜下观察结果并计数500个细胞，计算凋亡细胞所占比例。

1.2.4 体外细胞增殖抑制实验 取指数生长期的A549细胞，制成1×105/L单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200 μl，弃上清 (培养液)，根据SC维生素B6的浓度分为0 mg/L组、1.0 mg/L组、2.5 mg/L组、5.0 mg/L组，每组3孔，在细胞孵育12、24、48、72 h后每孔分别加入5 g/L浓度的MTT 20 μl，孵育4 h，弃上清，加200 μl的DMSO，置于微量振荡器振荡5 min混匀，用酶联免疫检测仪测波长490 nm的吸光度值 (A值)，每组实验重复3次取均值。细胞增殖抑制率=［(对照组A值－空白组A值) － (给药组A值－空白组A值)］ /(对照组A值－空白组A值) ×100%。其中对照组为0 mg/L SC维生素B6干预组，空白组指单纯加入DMSO所检测值，给药组为不同浓度SC维生素B6干预组。

1.2.5 罗丹明123检测细胞线粒体膜电位 (ΔΨm)变化 分别收集不同浓度SC维生素B6处理后的A549细胞，每组细胞为1×106个。1×PBS洗涤2次后重悬于5 mg/L的罗丹明123(由线粒体摄取的阳离子亲脂染料，细胞内罗丹明123的摄取量与线粒体跨膜电位ΔΨm呈正相关)，在37℃、5%CO2条件下孵育30 min，用1×PBS洗涤2次，流式细胞仪检测细胞内的荧光强度。

1.2.6 Caspase3/7活性检测 分别取对数生长期A549细胞5 000个，共100 μl，加于96孔板中，每组3孔，加入终浓度为5 mg/L的SC维生素B6分别培养12 h，将Caspase－Glo 3/7底物和PBS混合，取100 μl加入上述标本中，混合孵育1 h后酶联免疫检测仪测波长405 nm处的A值，未加任何试剂的空白孔作参照，计算不同浓度SC维生素B6干预组与对照组A值的比值，确定活化程度。

1.2.7 蛋白印迹 (Western blotting) 收集不同浓度SC维生素B6处理后的A549细胞，每组107细胞，应用细胞核蛋白及胞质蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白及胞质蛋白，用考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓度，分装后置－20℃保存。取80 μg样品蛋白质加入等体积PBS，经5%浓缩胶和10%SDS－PAGE凝胶电泳后，用水浴式电转仪转至硝酸纤维素膜上。经5%BSA 37℃封闭1 h，分别加入小鼠抗人核因子κB(NF－κB)P65及I－κB单克隆抗体，4℃孵育过夜。用TBS漂洗5 min×3次，加入山羊抗小鼠HRP标记二抗，37℃孵育1 h，再次TBS漂洗5 min×3次。化学发光法检测后分析结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件进行分析。计量资料以(±s)表示，两组均数比较采用t检验;多组均数间比较用方差分析，组间两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学改变 对照组及5 mg/L的SC维生素B6处理48 h的A549细胞，Wright染色，光镜下观察细胞形态变化。对照组A549细胞贴壁生长，呈梭形或多角形，细胞质饱满，细胞核呈圆形或椭圆，体积大，染色质疏松 (见图1A);5 mg/L的SC维生素B6干预组细胞大部分脱落，细胞体积缩小，细胞质出现空泡样变，染色质高度浓缩边集，核碎裂、溶解(见图1B)。

图1 对照组及SC维生素B6干预组细胞A549形态学变化 (Wright染色，×400)Figure 1 The morphologic change of A549 cells treated with or without sodium cantharidate vitamin B6

2.2 Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡 Hoechst33342检测凋亡，正常细胞核的Hoechst着色的形态呈梭形、卵圆形，淡蓝色 (见图2A);而凋亡细胞的核由于浓集而呈亮蓝色或核呈分叶，碎片状，边集 (见图2B)。结果显示5 mg/L的SC维生素B6处理48 h后的A549细胞的凋亡细胞比例 (55.6±5.3)%与对照组 (3.3±1.9)%比较，差异有统计学意义 (t=17.6，P＜0.01)。

图2 Hoechst33342荧光染色检测SC维生素B6处理后A549细胞凋亡(×400)Figure 2 Detecting apoptosis after treated with sodium cantharidate vitamin B6with Hoechst33342 fluorescent staining

2.3 细胞生长抑制曲线实验结果 采用MTT比色法，对SC维生素B60、1.0、2.5、5.0 mg/L干预组处理A549细胞后0、12、24、48、72 h的细胞生长情况进行检测，结果显示:细胞增殖抑制率呈时间、剂量依赖性增加，5.0 mg/L组作用A549细胞72 h后，细胞增殖抑制率最大达到 (67.37±6.22)%，显著高于0 mg/L组 (t=20.21，P＜0.01，见图3)。

图3 不同浓度SC维生素B6作用于A549细胞不同时间后细胞生长抑制曲线图Figure 3 A549 cells growth inhibiting curve after treated with different concentration of sodium cantharidate vitamin B6

2.4 不同浓度SC维生素B6对A549细胞线粒体膜电位的影响 不同浓度SC维生素B6处理A549细胞12、24 h后，0 mg/L干预组A549细胞内罗丹明123荧光强度最强，随着SC维生素B6浓度的增加及时间的延长，细胞内罗丹明123荧光强度逐渐减弱，呈现时间依赖性和剂量依赖性减低 (见表1)。

2.5 Caspase－3/7蛋白活性及检测 SC维生素 B60、1、2.5、5.0 mg/L处理A549细胞12 h后，caspase－3/7活性分别为 (0.218±0.021)、(0.255±0.021)、(0.293±0.021)、(0.395±0.032)，不同浓度SC维生素B6干预组caspase－3/7活性比较，差异有统计学意义 (F=29.73，P=0.00);且1.0、2.5、5.0 mg/L干预组caspase－3/7活性均显著高于0 mg/L干预组，差异均有统计学意义 (P＜0.05)。可见Caspase－3/7蛋白活性呈现剂量依赖性升高。

2.6 细胞凋亡相关基因NF－κB P65及I－κB蛋白检测 应用Western blot检测2.5 mg/L SC维生素B6处理A549细胞24、48 h后NF－κB P65及I－κB蛋白表达水平。结果显示:2.5 mg/L SC维生素B6处理A549细胞24、48 h后，NF－κB P65表达水平显著降低，并呈时间依赖性，而I－κB蛋白表达水平则无显著变化 (见图4)。

表1 不同浓度SC维生素B6处理12、24 h后A549细胞线粒体膜电位的变化 (n=3)Table 1 The change of mitochondrial membrane potential after treated with different concentration of sodium cantharidate vitamin B6in 12 or 24 hours

图4 2.5 mg/L SC维生素B6处理A549细胞不同时间后NF－κB P65及I－κB蛋白表达水平变化Figure 4 The protein levels of NF－κB P65 and I－κB protein after A549 cells treated with 2.5 mg/L sodium cantharidate vitamin B6in different time

3 讨论

肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，手术、放疗及化疗目前仍是肺癌治疗的首选措施和最有效的方法。肺癌早期缺乏特异的症状，大多数患者就诊时已属中晚期，同时出现胸腔积液及远处转移。通常只有10%～30%的患者能接受根治性切除手术，导致肺癌患者的整体预后差［1］。目前认为，只有通过综合性治疗才能真正延长肺癌患者生存期。中医药在肺癌的治疗中发挥着重要作用，中西医结合治疗已成为肺癌治疗的一种重要手段［2］。CTD为我国传统中药斑蝥的活性成分，并对多种肿瘤有一定的治疗效果，同时具有升高白细胞而无骨髓抑制等优点［3－9］。多种肿瘤组织中存在 NF－κB及 FAK活性，从而导致肿瘤细胞增殖、侵袭性增加并远处转移［10－11］。有研究显示CTD能够抑制NF－κB及黏着斑激酶 (FAK)磷酸化而抑制肿瘤的增殖及血管新生［6］。SC系CTD的半合成药物，具有提高机体免疫力、升高白细胞等疗效，多用于中晚期恶性肿瘤的治疗［7－9］。SC维生素B6注射液是SC和维生素B6的螯合物，其诱导肺癌细胞凋亡的机制尚不清楚。

本研究结果显示，SC维生素B6作用对肺癌细胞系A549细胞的增殖有明显的抑制作用。5.0 mg/L的SC维生素B6处理48 h后，A549细胞出现明显凋亡形态改变;72 h后，细胞增殖抑制率最大达到67.37%。

线粒体膜电位是由线粒体内膜两侧质子及其他离子不平衡而形成的，是保持线粒体功能所必需的。在线粒体内、外膜交界处存在一种蛋白性孔道，即膜渗透性转换通道 (PTP)，其受到损伤刺激后开放，引起线粒体膜电位的下降，释放细胞色素C等，最终激活Caspase－3，诱导细胞凋亡［12－14］。本研究结果显示，经不同浓度的SC维生素B6处理12、24 h后，A549细胞线粒体膜电位水平明显降低，呈现时间剂量依赖性。研究表明Caspase－3/7为凋亡执行分子，激活后表明细胞进入凋亡的最后阶段。Caspase－3以酶原的形式存在于细胞质中，在凋亡的早期阶段被激活，活化的Caspase－3由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应的细胞质细胞核底物，最终导致细胞凋亡［13－16］。本研究结果显示:SC维生素 B6抑制A549细胞后，细胞启动凋亡程序，Caspase－3/7蛋白活性在12 h内明显增加，并呈现时间、剂量依赖性。

NF－κB广泛存在于真核细胞内，是将信息从细胞质传至细胞核引起相应基因表达的重要的转录因子。NF－κB的异常激活可诱导促癌基因c－myc的激活，使其过量表达而抑制细胞凋亡、促进细胞的增殖。NF－κB也能直接抑制重要的凋亡相关分子Caspase－8的活化，从而抑制Caspase－3等一系列下游Caspases级联反应，最终抑制肿瘤细胞凋亡。研究表明，NF－κB在多种抗癌药物诱导肿瘤细胞凋亡的过程中起作用，肿瘤细胞NF－κB的活化是其对抗癌药物诱导细胞凋亡产生抗性的机制［15－17］。本研究显示:肺癌细胞系A549细胞高表达NF－κB，2.5 mg/L SC维生素B6处理A549细胞24、48 h后，NF－κB蛋白表达水平逐渐减低，而I－κB表达水平无显著变化，同时Caspase－3/7活性增加，故推测SC维生素B6通过抑制NF－κB表达而增强了Caspase－3/7的活性，从而诱导细胞凋亡。

综上所述，SC维生素B6具有高效促肺癌A549细胞凋亡及抑制增殖作用，是一种有效的肺癌治疗药物，对于其临床效果的观察及其作用机制的研究将是今后工作的重点。

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Effects of Sodium Cantharidate Vitamin B6on Proliferation，Apoptosis and Influence of NF－κB and Caspase3/7 on Hu-man Lung Cancer A549 Cells

WEN Xing －chu，WANG Yi－fei，LI Ai－ming，et al.Department of Surgical Oncology，the First Hospital of Baoding，Baoding 071000，China

ObjectiveTo investigate the effect of sodium cantharidinate(SC)vitamin B6on human non－small cell lung cancer A549 cell proliferation，apoptosis and the influence of transcription factor NF － κB and apoptosis molecules Caspase3/7.MethodsDifferent concentrations of SC vitamin B6and A549 cells were cultured together;Cells apoptosis was tested by light microscopy and fluorescent staining Hoechst33342 morphology;MTT assay tested cell proliferation;Rhodamine 123 examined mitochondrial membrane potential;Caspase3/7 activity assay kit tested Caspase3/7 activity;Western blot detected of NF－κB P65，I－κB protein levels.ResultsSC vitamin B6inhibited the A549 cells proliferation，of which there were apparent apoptotic morphological changes.When 5.0 mg/L group roled in A549 cells 72 h，cell proliferation inhibition rate reached 67.37 percent maximum.Mitochondrial membrane potential results showed that with increasing concentration of SC vitamin B6and time，the mitochondrial membrane potential gradually weakened，while Caspase3/7 protein activity increased.After SC vitamin B6was added in A549 cells，NF－κB P65 protein levels was reduced(P ＜0.05)and I－κB protein levels had no changes.ConclusionSC vitamin B6inhibits the NF－κB P65 expression，activates caspase－3/7 activities which inhibits A549 cells proliferation and induce apoptosis.

Carcinoma，non－small－cell lung;Sodium cantharidinate vitamin B6;A549 cell line;Membrane potential，mitochondria;Caspase3/7;NF －kappa B

R 734.2

A

1007－9572(2011)12－4176－04

071000河北省保定市第一医院肿瘤外科 (温省初，王一飞，李爱明，李冠军)，血液内科 (成志勇，王亚丽);保定市第二医院外科 (石林)

2011－05－10;

2011－10－23)

(本文编辑:刘莉)