赤芍总苷抑制人黑色素瘤A375细胞株增殖作用的研究

王亚珍，吕品田，王凤红，王辰英，焦俊芳，郑振茹

赤芍总苷抑制人黑色素瘤A375细胞株增殖作用的研究

王亚珍，吕品田，王凤红，王辰英，焦俊芳，郑振茹

目的 观察赤芍总苷 (TPG)对人黑色素瘤A375细胞增殖的影响及其作用机制。方法 黑色素瘤A375细胞，分别加入12.5、25、50、100、200 mg/L TPG，对照组加等量0.9%氯化钠注射液，孵育48 h。采用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)方法测定细胞生长抑制率，用RT－PCR、Western blot法分别检测增殖细胞核抗原 (PCNA)、P21、P27、P53 mRNA及其蛋白的表达水平。结果 不同浓度 (12.5、25、50、100、200 mg/L)TPG刺激后，对黑色素瘤细胞均具有明显的增殖抑制作用。100 mg/L TPG作用黑色素瘤细胞48 h，PCNA mRNA及其蛋白表达水平较对照组显著下降，而P21、P27、P53的mRNA及其蛋白表达水平较对照组显著上升，差异有统计学意义 (P＜0.01)。结论 TPG抑制黑色素瘤A375细胞增殖，与下调PCNA表达及上调P21、P27、P53表达有关。

赤芍总苷;人黑色素瘤细胞;细胞增殖;增殖细胞核抗原

赤芍是重要的活血化瘀中药，常以复方组成成分作用于肿瘤和血瘀症的治疗。赤芍总苷 (total paeonyglucosides，TPG)为中药赤芍的提取物。目前，仅有少数研究报道TPG对肿瘤细胞的生长有抑制增殖、促进凋亡的作用［1］，但具体机制尚未阐明。本研究以恶性黑色素瘤细胞作为研究对象，观察TPG对细胞增殖活性和增殖细胞核抗原 (PCNA)、P21、P27、P53 mRNA及蛋白表达水平的影响，为开发新的抗肿瘤药物及临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 黑色素瘤A375细胞株购自中国科学院上海细胞研究所，RPMI1640培养基、胎牛血清 (美国 Gibco公司)、MTT(美国Sigma公司)，RT－PCR试剂盒 (大连宝生物工程有限公司)，PCNA、P21、P27、P53一抗 (美国Santa Cruz公司)，引物由上海生工生物技术公司合成，赤芍总苷由河北医科大学药学院惠赠。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测细胞增殖活性 黑色素瘤A375细胞以含10%胎牛血清的RPMI1640常规培养，将对数生长期的细胞接种于96孔板，饥饿24 h使细胞同步于G0期。分别以不同浓度 (12.5、25、50、100、200 mg/L)TPG 刺激 48 h，或以100 mg/ml TPG刺激不同时间 (24、48 h)，对照组加等量0.9%氯化钠注射液，四甲基偶氮唑蓝 (MTT)孵育4 h后弃去上清，再加二甲基亚砜 (DMSO)孵育10 min，酶标仪上测其吸光度值。每组设6个复孔，实验重复3次。生长抑制率(%)=(1－TPG组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.2 总RNA的提取及RT－PCR 以100 mg/L TPG刺激黑色素瘤细胞48 h，收集细胞，Trizol一步法提取总RNA，按RT－PCR试剂盒说明进行反转录及PCR反应。PCNA引物序列:上游5'－ GTGAATTTGCACGTATATGCCG－3'，下游5'－GCAATTTTATACTCTACAACAAGGGG －3'，扩增产物长 302 bp。P21引物序列:上游5'－CCCGTGAGCGATGGAACTT－3'，下游5'－ GCGTTTGGAGTGGTAGAAATCT－3'，扩增产物长332 bp。P27引物序列:上游5'－TGCGAGTGTCTAACGGGAG－3'，下游5'－ CCTTCTCCACCTCTTGCCA －3'，扩增产物长234 bp。P53引物序列:上游5'－GCGCCATGGCCATCTACAAG－3'，下游 5'－ GAGTCTTCCAGTGTGATGATGGT－3'，扩增产物长308 bp。内参照GAPDH引物序列:上游5'－ACCACAGTCCATGCCATCAC－3'，下游 5'－TCCACCACCCTGTTGCTG－3'，扩增产物长452 bp。PCR反应条件为95℃ 4 min，预变性后，95℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 30 s，25个循环后，72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，凝胶成像分析系统进行密度分析。GAPDH作为内参照，比较各目的基因片段密度值/内参照密度值的比值。

1.2.3 Western blot法检测PCNA、P21、P27及P53蛋白的表达 以100 mg/L TPG刺激黑色素瘤细胞48 h，收集细胞，常规方法裂解细胞提取总蛋白，用改良Lowry法进行蛋白定量。取100 μg蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗4℃孵育过夜，PBS漂洗三次后，二抗辣根过氧化酶 (HRP)－IgG(1∶1 000)室温孵育2 h，洗膜，化学发光法显色，对条带进行灰度扫描。GAPDH作为内参照，比较各蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计检验。计量资料以(±s)表示，两样本均数比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TPG对黑色素瘤A375细胞活力的影响 MTT实验结果显示，TPG可明显抑制黑色素瘤细胞的增殖活性，在12.5、25、50、100、200 mg/L浓度范围内，随着药物浓度的增加，对视网膜母细胞瘤细胞增殖活性的抑制作用亦明显增强，呈现明显的浓度依赖效应。药物作用24 h及48 h实验均证实这一结果，其中100 mg/L浓度作用细胞48 h时抑制作用已较为显著 (见图1)。

2.2 TPG对黑色素瘤细胞PCNA、P21、P27及P53 mRNA表达的影响 RT－RCR结果显示，100 mg/L TPG作用黑色素瘤细胞48 h后PCNA mRNA表达水平较对照组显著下降，差异有统计学意义 (P＜0.01)，是对照组的66.2%;而细胞周期抑制因子P21、P27、P53 mRNA水平则较对照组显著上升，差异有统计学意义 (P＜0.01)，分别是对照组的2.16、2.00、1.97、1.94倍 (见表1、图2)。

图1 不同浓度的TPG作用不同时间后对人黑色素瘤A375细胞抑制率的影响Figure 1 Inhibitory effects of TPG on proliferation of human melanoma A375 cells at different time and concentration

表1 TPG对黑色素瘤细胞PCNA、P21、P27、P53 mRNA表达的影响(n=6，±s)Table 1 Expression of PCNA，P21，P27，P53 mRNA after treatment with TPG in human melanoma A375 cells

表1 TPG对黑色素瘤细胞PCNA、P21、P27、P53 mRNA表达的影响(n=6，±s)Table 1 Expression of PCNA，P21，P27，P53 mRNA after treatment with TPG in human melanoma A375 cells

组别PCNA P21 P27 P53对照组0.68±0.08 0.32±0.04 0.34±0.05 0.33±0.04 TPG组 0.45±0.06 0.69±0.07 0.67±0.09 0.64±0.08 t 5.63 －11.24 －7.85 －8.49 P值值＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

图2 TPG对黑色素瘤细胞PCNA、P21、P27、P53 mRNA表达的影响Figure 2 Expression of PCNA，P21，P27，P53 mRNA after treatment with TPG in human melanoma A375 cells

2.3 TPG对黑色素瘤细胞PCNA、P21、P27及P53蛋白表达的影响 Western blot结果显示，100 mg/L TPG处理黑色素瘤细胞48 h后PCNA水平较对照组显著下降，差异有统计学意义 (P＜0.01)，是对照组的47.0%;而细胞周期抑制蛋白P21、P27、P53水平则较对照组显著上升，差异有统计学意义(P＜0.01)，分别是对照组的2.50、2.03、2.31倍 (见表2、图3)。

表2 TPG对黑色素瘤细胞PCNA、P21、P27、P53蛋白表达的影响(n=6，±s)Table 2 Expression of PCNA，P21，P27，P53 protein after treatment with TPG in human melanoma A375 cells

表2 TPG对黑色素瘤细胞PCNA、P21、P27、P53蛋白表达的影响(n=6，±s)Table 2 Expression of PCNA，P21，P27，P53 protein after treatment with TPG in human melanoma A375 cells

组别PCNA P21 P27 P53对照组0.66±0.09 0.28±0.04 0.33±0.05 0.29±0.04 TPG组 0.31±0.06 0.70±0.09 0.67±0.09 0.67±0.08 t 7.93 －10.45 －8.09 －10.41 P值值＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

图3 TPG对黑色素瘤细胞PCNA、P21、P27、P53蛋白表达的影响Figure 3 Protein expression of PCNA，P21，P27，P53 of human melanoma A375 cells treated with TPG

3 讨论

寻找天然的高效低毒抗癌活性成分或先导化合物一直是研究的热点［2－6］，新近发现的TPG即具有高效低毒的特点。研究表明，TPG具有抗肿瘤的作用［7－8］，然而其具体机制尚不明确。本实验采用MTT法观察了不同浓度TPG作用不同时间对黑色素瘤细胞增殖的影响，结果显示12.5、25、50、100、200 mg/L TPG对黑色素瘤细胞增殖均有抑制作用，且呈剂量依赖关系，其中以100、200 mg/L TPG作用效果最为明显。TPG刺激48 h较24 h抑制作用明显。因此，本研究选择100 mg/L TPG刺激黑色素瘤A375细胞48 h，进一步观察其对黑色素瘤细胞增殖抑制的mRNA水平和蛋白水平的影响。

肿瘤的增殖活性决定了它的恶性程度，肿瘤细胞增殖程度越高，肿瘤组织生长越快，越容易发生转移，恶性程度越高。PCNA的合成与DNA复制和细胞增殖直接相关，是控制DNA复制以及细胞分裂的关键因素，因此它的表达程度反映了细胞增殖活性的高低，目前已把它作为衡量细胞增殖状态的一个客观指标［9］。此外，本研究还检测了与细胞周期密切相关的其他蛋白，其中细胞周期抑制蛋白P21、P27可阻抑细胞周期进程，降低细胞的增殖活性;野生型P53作为抑癌基因，能够抑制肿瘤细胞增殖，使细胞停滞于G0/G1期，从而诱导细胞凋亡［10］。该基因突变后抑癌作用减弱或消失，则会导致癌症的发生。因此，P53基因在肿瘤的发生过程中也发挥着非常重要的作用［11－12］。本实验证明了100 mg/L TPG对黑色素瘤细胞生长抑制的作用最为明显，并从分子生物学角度进一步检测了细胞内周期相关蛋白PCNA、P21、P27和P53 mRNA及蛋白水平的变化，结果显示，与对照组比较，黑色素瘤细胞PCNA mRNA及其蛋白表达均明显下降，P21、P27、P53 mRNA及其蛋白表达均显著升高，提示TPG能通过下调PCNA蛋白的表达及上调P21、P27、P53蛋白的表达，来改变肿瘤细胞周期进程，发挥抗肿瘤的作用。

总之，TPG可抑制黑色素瘤细胞增殖，且具有浓度依赖性，这种增殖抑制与下调PCNA表达、上调细胞周期抑制蛋白P21、P27以及P53表达有直接关系。

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Inhibitory Effect of Total Paeonyglucosides on Proliferation of Human Malignant Melanoma A375 Cells

WANG Yazhen，LV Pin －tian，WANG Feng －hong，et al.Health Department，Hebei General Hospital，Shijiazhuang 050051，China

ObjectiveTo investigate the effects of total paeonyglucosides(TPG)on proliferation of human malignant melanoma A375 cell，and to further elucidate its molecular mechanisms.MethodsHuman malignant melanoma cells were cultured with TPG(12.5，25，50，100，200 mg/L)and the control group was cultured with 0.9%NaCl injection for 48h.The rates of growth inhibition were tested by MTT assay.RT－PCR and Western blot were used to test PCNA，P21，P27 and P53 mRNA and the expression of protein.ResultsThe proliferation of human malignant melanoma cells was obviously inhibited by TPG of different concentrations(12.5，25，50，100，200 mg/L).After culturing with 100 mg/L TPG for 48 h，the level of PCNA mRNA and the level of its protein expression in malignant melanoma cells were significantly decreased compared with control group，while the level of mRNA in P21，P27 and P53 and the level of their protein expression were significantly increased(P ＜0.01).ConclusionTPG can inhibit human malignant melanoma proliferation by down－regulating the expression of PCNA and up－regulating P21，P27 and P53.

Total paeonyglucosides;Human malignant melanoma cell;Cell proliferation;Proliferating cell nuclear antigen

R 739.5

A

1007－9572(2011)12－4173－03

河北省科技厅科研基金资助项目 (10276105D－65)

050051河北省石家庄市，河北省人民医院保健处 (王亚珍，王辰英)，肿瘤科 (吕品田，郑振茹)，院办室 (王凤红);广平县人民医院妇产科 (焦俊芳)

吕品田，050051河北省石家庄市，河北省人民医院肿瘤科;E－mail:gotoireland2002@yahoo.com.cn

2011－09－10;

2011－11－14)

(本文编辑:刘莉)