大鼠钙化血管中蛋白激酶G与钙调神经磷酸酶信号通路的交互调节作用

苑晓烨 李绍冰 李芳 杨圣俊 曾强

动脉钙化在组织病理学上分为动脉内膜和动脉中层钙化。无论哪种钙化，都会引起血流动力学和机械力学的改变，最终将导致左心室肥大、心肌缺血和心律失常，并增加卒中和猝死的危险。血管钙化与骨代谢及血管平滑肌细胞(vascular smooth mucle cell，VSMC)表型转换关系密切。环三磷酸鸟苷依赖的蛋白激酶I(cGMP-dependent protein kinase，PKGI)及钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)在参与调节血管平滑肌细胞增殖及骨代谢中发挥重要作用。既往研究发现培养VSMC内NO/PKG信号通路和/CaN信号存在交互调节作用［1］。但是，在血管钙化中NO-cGMP-PKG I通路与钙-CaN信号通路之间是否存在交互调节作用，进而影响血管钙化进程并不完全清楚。本研究旨在探讨大鼠血管钙化过程中NO-cGMP-PKG I通路与钙-CaN通路之间是否存在交互调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料 华法令、维生素D3购自Sigma公司;环孢霉素A(CsA，Sandimmum)购自Novartis公司;维生素K1为无锡市第七制药有限公司生产;SD雄性大鼠购自河北医科大学实验动物中心，PKGI α-mRNA原位杂交检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司合成，CaNA α mRNA原位杂交检测试剂盒由天津灏洋生物制品科技有限责任公司合成。

1.2 动物分组及钙化血管的制备 参照文献［2］将实验动物随机分为对照组、钙化组、钙化+CsA组(CsA组)，每组12只。实验第1 ～8 天，3 组均给予维生素 K115 mg·kg－1·d－1，皮下注射，同时C组另给予CsA 10 mg·kg－1·d－1腹腔注射，A组和B组分别给予等量0.9%氯化钠溶液腹腔注射;实验第3天开始，B、C 组另给予维生素 D33 ×105U·kg－1·d－1，皮下注射，持续至实验第5天，及华法令15 mg/100 g，12 h 1次，皮下注射，持续至第8天，对照组在相同时间给予等量0.9%氯化钠溶液皮下注射;实验第9天，所有动物以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后处死。

1.3 标本采集 大鼠处死前12 h禁食不限水，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，将大鼠置于冰盒上，开胸，暴露出心脏，分离胸主动脉，并向下剖开腹部，分离出腹主动脉，从主动脉根部至腹主动脉分叉处剪下主动脉，迅速置于4℃预冷的0.9%氯化钠溶液中冲洗，直至盐水清凉，置于有0.1%二乙基焦碳酸酯(DEPC)的多聚甲醛溶液中，经常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，每段血管均匀切片3～4张，分别做HE染色等形态学观察和免疫组化、原位杂交等检测。

1.4 HE染色 石蜡切片脱蜡至水;苏木素染色10 min;自来水冲洗2～5 min;1%的盐酸酒精分化;自来水冲洗;0.1%的氨水返蓝;自来水充分冲洗;0.5%伊红染色2 min;自来水冲洗;常规梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。

1.5 原位杂交测定

1.5.1 PKGI α-mRNA 探针合成序列:①5’-AGACCTACAGGTCCTTCCACGACCTGCGCCAGGCG 3’;②5’-TGATCGACAATGTTTTCAAACAATAATGATGAGAA 3’;③5’-ACACGAGACAGCAGGAGCACATCCGCTCAGAGAAG 3’。步骤:石蜡切片脱蜡至水;置过氧化氢封闭液室温15 min;切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶;滴加预杂交液;滴加杂交液覆盖组织44℃湿盒孵育过夜;杂交后的洗涤;滴加封闭液;滴加生物素化鼠抗地高辛;滴加SABC;滴加生物素化过氧化物酶，原位杂交用PBS洗;DAB显色，苏木素复染;常规梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。

1.5.2 CaN Aα-mRNA 探针合成序列:①5’-CGGTG ACTTG GCGGA AATGG AACGG CTT;②5’-AAGAA GAGGT AGCGA GTGTT GGCAG GAG;③5’-CGAAG GCATC CATAC AGGCG TCATA AAC。探针①、②和③混合标记地高辛。步骤:石蜡切片脱蜡至水;置打孔液中室;置过氧化氢封闭液室温20 min，0.01 mol/L PBS冲洗3次;滴加复合消化工作液室，0.01 mol/L PBS冲洗3次，0.2×ssc(标准柠檬酸盐溶液)洗1次;滴加预杂交工作液覆盖组织37℃湿盒孵育1 h;预杂交后的洗涤;滴加杂交工作液覆盖组织42℃湿盒孵育过夜;杂交后的洗涤;滴加大鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，覆盖组织37℃湿盒孵育45 min，0.01 mol/L PBS冲洗3次;滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合物工作液;DAB显色，苏木素复染;常规梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。

1.6 主动脉组织ALP活性测定 按照试剂盒说明书操作。定义每克组织蛋白(gprot)在37℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1单位。计算公式为:组织ALP活性(U/gprot)=(测定管吸光度 OD值/标准管吸光度 OD值 ×标准管酚含量(0.003 mg)/取样量中的蛋白克数。

1.7 将原位杂交结果 应用Image-Pro Plus图象分析软件，分别计算各组主动脉组织相同面积内阳性细胞的累积光密度值(integrated optic density，IOD)。

1.8 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，对计量资料进行正态性检验及方差齐性检验，组间资料比较应用单因素方差分析，两两比较应用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色 结果显示对照组大鼠主动脉壁结构完整，中层血管平滑肌细胞(VSMCs)排列整齐(图1);钙化组大鼠主动脉中层VSMCs排列紊乱，弹力纤维迂曲断裂(图2);CsA组大鼠主动脉中层VSMCs亦排列紊乱，弹力纤维层迂曲断裂(图3)。

2.2 原位杂交 3组大鼠主动脉可见 CaN Aα mRNA及PKGIα mRNA表达，主要位于胞浆中。见图4～6。钙化组与对照组比较:钙化组大鼠主动脉CaN Aα mRNA较对照组表达明显增加(P＜0.01)，PKGIα mRNA较对照组表达明显减少(P＜0.01);CsA组与对照组比较:CsA组大鼠主动脉CaNAα mRNA较对照组表达明显增加(P＜0.01)，PKGIα mRNA较对照组表达明显增加(P＜0.01);CsA组与钙化组比较:CsA组大鼠主动脉CaN Aα mRNA与钙化组比较表达明显减少(P＜0.01)，PKGIα mRNA 较钙化组表达明显增加(P＜0.01)。见表1。

表1 原位杂交结果及主动脉组织ALP活性测定n=6，

表1 原位杂交结果及主动脉组织ALP活性测定n=6，

注:与对照组比较，*P＜0.01;与钙化组比较，#P＜0.05，△P＜0.01

组别 CaN A αmRNA(IOD)PKGIα mRNA(IOD) ALP(U/gprot)对照组 10302±2636 8713±740 360±49钙化组 26421±1698* 5774±643* 463±65*CsA组 16775±4030# 11044±972# 480±75#

2.3 ALP活性 钙化组ALP活性(463±65)U/gprot较对照组(360±49)U/gprot增加(P＜0.05);CsA组ALP活性(480±75)U/gprot较对照组(360±49)U/gprot明显增加(P＜0.01)，CsA组ALP活性(480±75)U/gprot与钙化组(463±65)U/gprot比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。

3 讨论

以往认为血管钙化是衰老时出现的异位骨化，是血管疾病终末期所出现的变性表现，是钙盐在细胞内和细胞外基质的被动沉积。然而新近的许多研究发现，血管钙化并不是磷酸钙结晶在血管壁的简单而被动的沉积，而是钙盐沉积在细胞内(细胞内钙超载)和细胞外基质的复杂的、主动的、并且可能是高度可调的过程，类似于骨和软骨形成过程中的骨化。

本研究钙化血管中，大鼠主动脉PKGIα mRNA表达减少，CaN Aα mRNA表达增加，推测PKG影响CaN的表达。近年证实血管钙化是一个受调控的、类似于骨形成的主动过程，钙化的动脉有成骨细胞和破骨细胞，钙化的基质被骨基质取代，有新生血管侵入［3，4］。在骨组织，CaN、PKG 是破骨细胞发育必需的［5］，有研究证实CaN、PKG还参与成骨细胞分化及成骨作用［6－8］，CaN及PKG很可能通过成骨相关机制参与调节血管钙化。VSMCs能够向成骨细胞表型转化，是血管钙化的细胞学基础之一。研究证明CaN及PKG参与调节VSMCs分化，在血管成形术后再狭窄［9，10］及新生内膜形成中［11，12］具有重要作用。CaN、PKG很可能也参与VSMCs向成骨细胞转化和钙化。另外，血管钙化与 VSMCs凋亡密切相关［13，14］。CaN、PKG 参与 T淋巴细胞、心肌细胞等多种细胞的凋亡，CaN很可能参与VSMCs的凋亡。CaN信号通路在VSMC增殖及功能维持中起到重要作用。胞内Ca2+浓度控制着不同的细胞功能，包括基因表达、增殖、凋亡、粘附和迁移等，CaN可通过其去磷酸化作用调节Ca2+通道、影响胞内Ca2+浓度、参与VSMC增殖等功能活动的调控。一氧化氮(nitric oxide，NO)能够激发多种信号传导通路，刺激可溶性鸟苷环化酶催化细胞内cGMP合成，再由cGMP激活PKG调节局部和全身信号等。同时NO通过抑制肌浆网IP3受体和雷尼丁受体释放Ca2+，以及介导cGMP和PKG抑制N型钙通道Ca2+内流，调节平滑肌细胞内钙离子浓度。PKG是广泛存在于真核细胞内的一种丝(苏)氨酸蛋白激酶，存在于多种组织细胞，是重要的信号分子NO的下游底物，能够在多种水平调节Ca2+水平，从而参与多种细胞功能调节。Fiedler等［15］发现PKG激活后可以抑制Ca2+从L型钙通道进入胞质，可以抑制CaN-NAFT信号通路，从而减少心肌细胞体积。故推测，在血管钙化过程中，PKG可通过Ca2+的浓度变化影响CaN的表达。

图1 对照组大鼠主动脉HE染色(HE×400)

图2 钙化组大鼠主动脉HE染色(HE×400)

图3 CsA组大鼠主动脉HE染色(HE×400)

图4 对照组PKGⅠα mRNA表达(HE×400)

图5 钙化组PKGⅠα mRNA表达(HE×400)

图6 CsA组PKGⅠα mRNA表达(HE×400)

本实验给予CaN抑制剂CsA后，钙化血管中CaN Aα mRNA表达减少，而PKG Iα mRNA的表达及钙化的标志物ALP却有增加的趋势，推测CaN抑制钙化血管中PKG Iα的表达。其机制可能为:CaN介导的脱磷酸化和核转位作用在信号传导途径中是一中枢性事件。它不仅本身可介导多条信号传导通路，而且通过其去磷酸化作用可对其他信号通路进行调节，使Ca2+信号与其他第二信使的调节机制发生“交谈”，协同调节细胞的功能。在钙化血管中CaN激活，使受磷蛋白(phospholamban，PLB)去磷酸化而活化，PLB能够抑制肌浆网钙-ATP酶(SERDA2a)的活性，从而减少肌浆网对胞浆内Ca2+的重吸收，使细胞浆内Ca2+水平升高，上调一氧化氮合酶活性，NO水平增加，继而生成大量cGMP，激活蛋白激酶A，抑制PKG Iα表达［16］。当用特异性抑制物CsA阻断CaN活性后，上述过程被抑制，从而使PKG Iα表达明显增加。

本研究结果提示，培养钙化血管内NO/PKG信号通路和Ca2+/CaN信号存在交互调节作用。血管钙化可以引起血流动力学和机械力学的改变，动脉管壁僵硬，收缩压升高、舒张压降低，脉压差增大，冠状动脉灌注降低，最终将导致左心室肥大、心肌缺血和心律失常，并增加卒中和猝死的危险［17，18］。已经证实CaN-NFAT信号通路是促进细胞肥大重要调节者，明确CaN与PKG I之间的相互关系有助于了解血管钙化的可能发病机制，并为抗血管钙化的药物治疗提供了可能的新途径。

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