血管紧张素原基因M235T多态性与下肢深静脉血栓的关系

石晓明 吴胜春 吕柏南

血管紧张素原(AGT)是肾素-血管紧张素系统(RAS)中的唯一初始底物，血浆中AGT水平的高低，直接影响着RAS活性的强弱，近来研究的焦点多集中在其与原发性高血压、心肌梗死的关系上，结果发现AGT基因外显子2中M235T(235位氨基酸由苏氨酸代替蛋氨酸)多态与原发性高血压、心肌梗死有关［1－3］。本文研究了M235T在下肢深静脉血栓(DVT)患者中的分布情况，为该位点与疾病的相关性研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2004年11月至2009年5月于我科就诊的DVT患者72例(DVT组)，其中男40例，女32例;年龄25～84岁，平均年龄(52±9)岁。对照组为我院门诊健康体检者80例，其中男44例，女36例;年龄28～65岁，平均年龄(47±8)岁。DVT患者除临床表现外，均有血管超声或深静脉造影等影像学证据予以证实。2组检测血、尿、便常规、心电图、B超未发现异常，均除外高血压、心血管病、慢性肝病、糖尿病、糖尿病肾病等慢性内科疾病，排除应用影响凝血功能药物者。2组一般资料具有均衡性。

1.2 方法 抽取空腹外周静脉血3 ml，EDTA抗凝，－80℃低温冰箱保存，用于提取DNA。用常规酚/氯仿方法提取DNA，进行目的基因片段聚合酶链反应(PCR)扩增及限制性片段长度多态(RFLP)分析。AGT基因引物序列参照Russ等［4］的设计，由上海生工生物工程有限公司合成。序列为5’-CGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTC-3’，5’-AGGGTGCTGTCCACACTGGACCC-3’(AC为非配对碱基)。当在AGT基因外显子2核苷酸704处T转变成C，并不改变限制性位点，但产生一个适合被Tth111Ⅰ(GACNNNGTC)酶切的“半位点”，另一个“半位点”的引入是通过存在两个非配对碱基(下划线)的PCR引物来完成。两个非配对碱基不干扰PCR的延伸。反应总体积为30 μl，将 PCR 产物进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压 80 V，时间40 min，PCR Marker作参照，紫外灯下观察结果。取PCR产物1 μl加入内含5 U Tth111Ⅰ限制性内切酶(Promega公司)的12 μl缓冲液体系中，65℃水浴，消化 4 h。取酶切后产物10 μl，配制8%聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳，电压200 V，电泳40 min。10%乙醇 +0.5%冰醋酸固定，0.2%硝酸银染色，0.75%氢氧化钠+0.2%甲醛显色。电泳结果分型:AGT基因M等位基因纯合型(235MM型)因无酶切位点，显示一条163 bp的扩增片段;AGT基因T等位基因纯合型(235TT型)因在外显子2核苷酸704处T变成C，故可被Tth111Ⅰ酶切，产生一条新的140 bp的片段;AGT基因M235T杂合型(235MT型)则同时具有163 bp和140 bp两种片段。

1.3 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

DVT组中，235TT型为50例，235MT型为18例，235MM型为4例;对照组分别为42、30、8例。DVT组TT基因型频率为69.4%，高于对照组52.5%(χ2=4.554，P＜0.05)。DVT 组 T等位基因频率为81.9%，高于对照组的71.3%，但差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。

表1 2组AGT基因型及等位基因频率的分布 例(%)

3 讨论

DVT形成是临床常见的周围静脉病变，其形成深静脉血栓的三大因素为血流滞缓、静脉壁损伤、血液高凝状态，若治疗不及时，血栓蔓延，易并发肺栓塞，从而危及生命［5］。流行病学研究表明严重危害人类健康的心肌梗死、脑梗死、肺栓塞等疾病的发生和发展均与血栓形成有着密切的关系，因此对血栓的研究已成为热门课题。

国内外对血栓形成性疾病的研究主要集中于凝血、纤溶、RAS基因的多态性等方面。AGT是 RAS的重要组成成分之一，是生成具有高生物活性的血管紧张素的基底物质，具有强烈的舒缩血管活性，能影响体内血压调节和水盐平衡。AGT基因位于1q42-43处，编码区由5个外显子和4个内含子构成。Jeunemaitre等［6］对 AGT所有外显子和 5’非编码区的一个682 bp片段进行了研究，发现15个明显的分子变异，其中2号外显子704核苷酸处胸腺嘧啶(T)被胞嘧啶(C)所代替，导致编码产物第235号氨基酸由蛋氨酸(Met)变为苏氨酸(Thr)，由此产生三种基因型:无突变M等位基因纯合型(235MM型)，杂合型(235MT型)，有突变T等位基因纯合型(235TT型)。

目前对AGT多态性的研究多集中于原发性高血压和心肌梗死。Jeunemaitre等［6］对高加索人的研究中发现，心肌梗死患者中AGT TT基因型比对照者高。在对原发性高血压患者研究中亦发现AGT基因与高血压关系密切［7］，且不同AGT基因型的高血压患者血浆中AGT浓度不同。但也有研究显示AGT与高血压无关［8］。本研究结果表明，DVT患者中TT基因型频率69.4%高于对照组52.5%(P＜0.05)，T 等位基因频率81.9%高于对照组71.3%(P ＞0.05)，提示TT基因型与DVT明显相关，AGT多态性为DVT的风险提示因子，因此检测AGT基因型，可以预先提示某些人有患DVT的趋势，据此采取某些预防措施，降低DVT的发病率，达到早期防治MI的目的。但DVT发病机制极其复杂，同时基因表达与种族、民族、地域、血缘等因素均有关系，其具体情况尚待进一步研究。

1 石晓明，吴胜春，吕柏楠.下肢深静脉血栓患者血管栓患者紧张素转换酶基因多态性检测的意义.河北医药，2010，32:2863-2864.

2 Kiec-Wilk B，Olszanecka A，Mikolajczyk M，et al.Role of the M235T(c.704c＞T)polymorphism of angiotensynogen gene as well as A724A(c.2171G＞A)polymorphism of SERCA2a gene in ethiopathogenesis of left ventricular hypertrophy in essential hypertension.Przegl Lek，2010，67:151-156.

3 SaudCG，Reis AF，Dias AM，et al.AGT*M235T polymorphism in acute ischemic cardiac dysfunction:the gisca project.Arq Bras Cardiol，2010，95:144-152.

4 Russ AP，Maerz W，Ruzicka V，et al.Rapid detection of the hypertensionassociated Met235--＞ Thr allele of the human angiotensinogen gene.Hum Mol Genet，1993，2:609-610.

5 范立想，兰静，左洪荣，等.下肢深静脉血栓形成的辨证施护.中国中医急症，2010，19:2165-2166.

6 Jeunemaitre X，Soubrier F，Kotelevtsev YV，et al.Molecular basis of human hypertension:role of angiotensinogen.Cell，1992，71:169-180.

7 路方红，杨建民，周晓红，等.家族性原发性高血压与基因多态性关系.中国公共卫生，2009，25:20-22.

8 向攀，李志卫，刘智，等.AGT基因M235T多态性和ACE基因I/D多态性与妊娠期高血压疾病的关系研究.中国妇幼保健，2010，25:5263-5266.