电穿孔法提高恶性疟疾DNA疫苗免疫原性

吴 巍 蔺亚晖 马瑞森 席珏敏 王 恒

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院，北京 100005)

引言

疟疾是当今世界对人类危害最为严重的传染性疾病之一。全球每年约有3.5亿人感染恶性疟疾，有100～150万人因这一疾病而死亡，其中大多数为非洲撒哈拉以南地区5岁以下的儿童［1］。控制疟疾的方法包括控制传播媒介，提高诊断率和治疗效果，采取疫苗预防等。目前，如何增强疫苗在人体内的免疫效果是疫苗研究过程中的一个关键问题。

有效的红内期疟疾疫苗能够抑制裂殖子侵入红细胞，降低疟原虫密度，从而减少发病率和死亡率。本课题组对红内期多表位疫苗的研制进行了长期的探索，前期工作借鉴了分子育种技术的随机重组原理，利用表位改组技术构建了多表位基因库，并用库免疫血清筛选出高抗原性的阳性克隆，发现其中M.RCAg-1基因克隆不仅能在小鼠模型诱导交叉免疫保护而且能在家兔模型中诱导抗恶性疟原虫抑制性抗体［2］;D10抗原也能在家兔模型中诱导抗恶性疟原虫抑制性抗体［3］。由于以上基因均需通过表达重组蛋白后免疫，提高了疫苗的制备和保存成本，而此前在尝试应用核酸疫苗免疫的研究中，通过肌肉注射的免疫途径诱导产生的抗体水平较低，抗血清对疟原虫生长抑制作用也不明显，因此需要选择新的免疫途径。

体内电穿孔作为一种有效的DNA疫苗递送途径，可以显著地增强DNA疫苗在动物体内的免疫效果。在电场的作用下，细胞膜上瞬间打开一个“孔”，能够提高目的基因进入细胞内的概率，从而提高表达效率。电穿孔导致的轻微组织损伤还可以诱导产生炎性细胞因子和淋巴细胞浸润，从而提高抗原递呈，增强机体的免疫应答［4－6］。本试验采用电穿孔途径，在动物模型中观察 M.RCAg－1和D10作为核酸疫苗的免疫原性及D10基因抗血清对疟原虫生长的体外抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、工具酶和试剂

6周龄的BALB/c小鼠、新西兰大白兔(中国医学科学院医学实验动物研究所提供)，限制性内切酶、Pfu DNA聚合酶等分子克隆工具酶(Takara公司，日本)，大量质粒快速抽提纯化提取试剂盒(Qiagen公司，德国)，真核表达载体 pVAX1(Invitrogen公司，美国)，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG、FITC偶联山羊抗鼠 IgG、封闭用羊血清原液和DAPI(北京中杉金桥生物公司)。

1.2 VR1012-M.RCAg-1 、pVAX1-M.RCAg-1、VR1012-D10、pVAX1-D10质粒的构建及制备

用PCR扩增法分别从pDS-exM.RCAg-1和pET30a-D10(该两个质粒为本研究室保存)中扩增M.RCAg-1和D10 cDNA片段，并用定向克隆法分别亚克隆入真核表达载体 VR1012、pVAX1中。经酶切分析和DNA测序证实克隆成功。

按无内毒素的Qiagen Mega 22500供应商的操作说明书分别制备 VR1012、pVAX1、VR1012-M.RCAg-1 、pVAX1-M.RCAg-1、VR1012-D10、pVAX1-D10的质粒。DNA的纯度260/280 A值均为1∶1.85～1.90。分别溶于0.9% 的无菌生理盐水中，－20℃保存待用。

1.3 电穿孔免疫

将实验动物随机分组，BALB/c小鼠每组5只，新西兰大白兔每组2只，通过CELLECTRA®电穿孔装置免疫。首先分别在动物后腿外侧肌肉注射20 μL(小鼠)和50 μL(兔子)质粒，分别采用三针式电极(小鼠)和六针式电极(兔子)，电极针插入肌肉，覆盖注射点，参数为:两个方波脉冲，恒流电流分别为0.1 A(小鼠)和0.5A(兔子)，持续52 ms，间隔时间为 1 s［7］。在第 0、2、4 周免疫，共 3 次。免疫前和每次免疫后的两周取血，检测特异性抗体滴度。

1.4 ELISA法检测免疫小鼠特异性抗体水平

免疫小鼠血清中特异性抗体采用间接ELISA法检测，包被抗原为 pDS-exM.RCAg-1和 pET30a-D10重组质粒在大肠杆菌中表达的重组蛋白M.RCAg-1和D10。3%BSA封闭后加入适当稀释的小鼠血清孵育，洗板后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体孵育，洗板后加底物显色，在酶标仪450 nm测量各孔A值。

1.5 间接免疫荧光(IFA)分析基因免疫小鼠血清对天然虫抗原的识别情况

将恶性疟原虫3D7株红内期混合期细胞均匀涂片并固定，加入适当稀释的血清孵育，洗涤后加入FITC标记的羊抗鼠抗体孵育，再洗涤后加封片剂和DAPI后在荧光显微镜下观察结果。IFA滴度的判定为阳性结果中血清的最高稀释度。

1.6 兔血清IgG的纯化

在免疫前和免疫后的第6周收集兔血清，按照蛋白A柱说明书亲合层析纯化兔血清的总IgG。用PBS透析后用于体外生长抑制试验。

1.7 体外生长抑制(GIA)

用山梨醇将恶性疟原虫3D7虫株环状体期细胞同步化两次。用正常人血细胞和完全培养基调节感染红细胞至4%悬液，分装于96孔板内，120 μL/孔;分别加入过滤无菌含不同浓度纯化抗体，每个浓度3个复孔，每孔30 μL;37℃正常蜡烛缸中培养48 h后，涂片，用Giemsa染色，镜检，计数3 000个细胞。生长抑制率按下列公式计［2］:

生长抑制率=［(对照组感染率－起始感染率)－(实验组感染率 －起始感染率)］/(对照组感染率－起始感染率)×100%。

1.8 统计学方法

应用 t检验法检测各组间的差异，显著差异水平为 P<0.05。

2 结果

2.1 免疫小鼠血清中特异性抗体测定

用 30 μg/鼠 的 重 组 质 粒 VR1012、pVAX1、VR1012-M.RCAg-1 、pVAX1-M.RCAg-1、VR1012-D10、pVAX1-D10分别经电穿孔技术免疫 BALB/c小鼠，于免疫后2、4、6周采血，分离血清，用 ELISA法检测血清的抗体滴度。抗原基因免疫组小鼠产生重组蛋白抗体，而载体对照组小鼠血清呈阴性反应。在连续接种过程中，血清抗体水平随接种次数而升高，于第3次免疫后达到最高水平。VR1012-M.RCAg-1和pVAX1-M.RCAg-1免疫组诱导出小鼠的抗体平均滴度均为1/102 400(见图1)。VR1012-D10免疫组诱导出小鼠的抗体平均滴度为1/51 200，而 pVAX1-D10免疫组为1/102 400，两组相比有显著性差异(P<0.01)(见图2)。

图1 恶性疟原虫多表位DNA疫苗M.RCAg-1接种BALB/c小鼠诱导产生的抗体Fig. 1 Antibody responses in BALB/c mice immunizedwithmulti-epitopeDNA vaccineM.RCAg-1 of Plasmodium falciparum

图2 恶性疟原虫多表位DNA疫苗D10接种BALB/c小鼠诱导产生的抗体Fig.2 Antibody responsesin BALB/cmice immunized with multi-epitope DNA vaccine D10 of Plasmodium falciparum

2.2 基因疫苗诱导血清特异性抗体对天然虫抗原的识别情况

经30 μg/鼠抗原基因免疫BALB/c小鼠3次后收集血清，用间接免疫荧光法分析各组小鼠血清对天然虫抗原的识别情况。结果显示抗血清均能识别恶性疟3D7株感染红细胞，VR1012-M.RCAg-1、pVAX1-M.RCAg-1组最高稀释滴度达1/40。VR1012-D10组最高稀释滴度达1/800，pVAX1-D10组达1/1 600。

2.3 不同免疫剂量的基因疫苗诱导血清特异性抗体测定

分别 用 10、30、100 μg/鼠 剂 量 的 pVAX1-M.RCAg-1和pVAX1-D10基因疫苗免疫小鼠3次后收集血清，检测血清特异性抗体水平。发现低、中、高剂量均能诱发特异性抗体产生，其中以低、中剂量组产生的抗体水平较高剂量组高，在低剂量和中剂量的免疫组诱导出小鼠的抗体滴度均为1/102 400，而高剂量组为1/51 200(见图3和图4)。两组相比有显著性差异(P<0.01)。

2.4 D10基因免疫兔纯化IgG体外对疟原虫生长的影响

用50 μg pVAX1-D10质粒免疫大白兔，免疫3次后收集血清，检测抗体滴度为1/102 400，纯化总IgG后体外检测IgG对3D7虫株生长的影响，发现在IgG浓度为2 mg/mL时对3D7的抑制率为45%，而且这种抑制作用呈现剂量依赖关系(见表1)。

3 讨论

图3 不同剂量基因疫苗M.RCAg-1接种BALB/c小鼠诱导产生的抗体 (横坐标中的L、M 和H分别代表低剂量、中等剂量和高剂量)Fig.3 Antibody responsesin BALB/cmice immunized with differentimmunedosesofM.RCAg-1 DNA vaccine(L，M and H represent lowdose、 middle-dose and high-dose group，respectively)

图4 不同剂量基因疫苗D10接种BALB/c小鼠诱导产生的抗体(横坐标中的L、M和H分别代表低剂量、中等剂量和高剂量)Fig.4 Antibody responsesin BALB/cmice immunized with different immune doses of D10 DNA vaccine(L，M and H represent low-dose、middledose and high-dose group，respectively)

表1 D10基因疫苗免疫后兔血清IgG体外对3D7虫株生长的影响Tab.1 Evaluation of inhibitory activities against 3D7 of D10 DNA vaccine-elicited antibodies in vitro

选择优化的表达载体可以提升抗原的表达效率，从而提高疫苗的免疫效果。本研究选用真核表达载体pVAX1和VR1012分别对M.RCAg-1和D10基因进行表达。这两种载体的共有特点是都用卡那霉素抗性筛选基因，减少抗性筛选基因和人类基因组发生重组的可能性;强启动子 pCMV和 BGH poly A信号可以在哺乳动物细胞中高水平表达重组蛋白。此外，pVAX1是由美国食品和药品管理委员会(FDA)推荐的唯一可以应用于人体实验的载体质粒，具有更高的生物安全性;这一载体分子量小，表达容量大［8］。本实验研究证明M.RCAg-1基因在pVAX1中表达的免疫效果与VR1012相同。而D10基因在pVAX1中的表达的免疫效果优于VR1012，所以在剂量摸索的试验中应用pVAX1表达载体。

免疫剂量是影响免疫效果的另一重要因素。过高的免疫剂量不但不能提高机体的免疫效果，反而会产生免疫抑制，同时也会增加经济投入。反之，剂量过小，不能刺激机体产生良好的免疫应答［9］。为了寻找 M.RCAg-1和 D10基因疫苗的最佳免疫剂量，本实验分3个剂量组(10，30，100 μg)免疫。结果证明 10 μg/鼠的剂量就足够诱导1/102 400的抗体滴度，增加免疫剂量到 30 μg/鼠时也不会使抗体滴度继续增加，当抗原过量达到100 μg/鼠时还会抑制抗体的产生。

对DNA疫苗进行优化还包括采用高效的基因递送途径。动物实验的研究结果表明体内电穿孔的免疫途径可以减缓肌细胞的周转率，从而延长抗原的生成时间［6］。因此，体内电穿孔作为肌肉注射的一种重要的辅助方法显示出了良好的应用前景，并可以增强DNA疫苗在多种动物中的免疫原性［4-6］。根据本实验室前期的研究结果显示，肌肉注射 VR1012-M.RCAg-1基因疫苗 100 μg/鼠可诱导1/1 600的抗体滴度［10］，而本实验通过电穿孔的传递方法免疫VR1012-M.RCAg-1基因疫苗10 μg/鼠即可诱导1/102 400的抗体滴度，可见电穿孔方法免疫可以提高基因的免疫效果。而且pVAX1-D10基因免疫兔血清IgG在浓度为2 mg/mL时对3D7的抑制率是45%，这个结果与本试验室前期用D10重组蛋白免疫结果接近［3］。可见应用电穿孔方法传递DNA疫苗同样可以诱导抗恶性疟生长的抗体，而且制备和纯化更加方便，是一种理想的基因递送途径。

4 结论

影响DNA疫苗的免疫效果的因素很多，如基因的表达载体、接种方式和免疫剂量等。通过实验发现，电穿孔的免疫途径与传统的肌肉注射方法相比提高了基因的免疫效果，同时还减少了免疫剂量。对于D10基因，pVAX1表达载体的免疫效果优于VR1012载体，为今后D10基因疫苗的研究提供更好的表达载体。在剂量的摸索中发现10 μg/鼠是最佳的免疫剂量。M.RCAg-1和D10的DNA疫苗的免疫血清均可识别恶性疟天然蛋白，并且D10基因免疫血清IgG在体外对恶性疟的生长进行抑制。另外，还有其他的方法可以提高DNA疫苗的免疫效果，需要在以后的工作中进行更多的研究。

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