人参皂苷对醛糖还原酶的抑制作用

孟凡丽，苏晓田，刘发贵，郑毅男，侯立娜

(1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130021;2.辽宁农业职业技术学院，辽宁 营口 115009)

糖尿病为一种常见病、多发病，目前我国糖尿病患者已超过4 000万人。由糖尿病并发症引起的死亡人数在发达国家继心脑血管疾病、癌症之后列第3位。糖尿病可引发白内障、视网膜病变、神经病变、肾功能不全及肾小球基底膜增厚等糖尿病慢性并发症。大量研究证实［1－2］，糖尿病并发症与糖代谢的多元醇通路有关，而醛糖还原酶(aldose reductase，AR)是该通路的关键限速酶。由糖代谢的多元醇通路激活机制发现，醛糖还原酶抑制剂(aldose reduetase inhibitors，ARIs)能有效抑制AR的活性，预防和延迟糖尿病并发症的发生和发展。人参皂苷是传统中药人参的主要活性成分，具有抗心肌缺血、抗脑缺氧缺血、抗衰老、抗氧化、抗疲劳、肾功能保护、降血脂和降血糖等功效［3－5］，但对于抑制糖尿病并发症尚未见报道，本研究测定人参皂苷对AR的抑制功效，以期发现人参皂苷在治疗糖尿病并发症方面潜在的价值。

1 材料与方法

1.1材料、试剂与仪器人参皂苷 Re、Rd、Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rb3、Rc，购自吉林大学化学学院天然药物化学研究室;新鲜牛眼睛由辽宁省营口市北方精制牛肉加工厂提供;DL-甘油醛和NADPH(还原型)分别购自美国Sigma公司和意大利Roth公司;牛血清白蛋白，购自北京奥博星生物技术责任有限公司;考马斯亮蓝，购自天津市瑞金特色化学品有限公司;依帕司他(Epalrestat，EPS)，扬子江制药公司。

760CRT双光束紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;GL-12B型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2方法

1.2.1牛眼晶状体中AR的分离参照Federico报道的方法［6］，稍加改良，所有步骤均在4℃以下进行。称取300g牛晶状体，加入3体积磷酸盐缓冲液中用组织捣碎机捣碎;12 000 r·min－1离心20 min，取上清液缓慢加入硫酸铵至0.40饱和度，间歇搅拌1 h;再 10 000 r·min－1离心 15 min，取上清液加入硫酸铵至0.50饱和度，间歇搅拌1 h;10 000 r·min－1离心15 min，取上清液加入硫酸铵至0.75饱和度，间歇搅拌 3 h，10 000 r·min－1离心 15 min，取沉淀用少量的0.05 mol·L－1氯化钠溶液溶解，透析12 h，即得AR粗提物，分装，－70℃冷冻保存备用。以牛血清白蛋白为对照品，采用Brad-ford染色法［7］测定AR粗提物中蛋白质的含量。

Tab 1 Inhibitory effect of ginsenoside on AR at 100 mg·L-1concentration(±s，n=15)

Tab 1 Inhibitory effect of ginsenoside on AR at 100 mg·L-1concentration(±s，n=15)

＊＊P＜0.01 vs control

Group Rg2 Rg1 Rb1 Rb2 Rb3 Rc Rd Re EPS(control)Inhibitory rate 1.573 0.901 0.034 －0.067 －0.253 －0.094 0.782 －0.415 0.453±0.176＊＊ ±0.038＊＊ ±0.009＊＊ ±0.011 ±0.026 ±0.010 ±0.056＊＊ ±0.047 ±0.029

1.2.2人参皂苷单体对AR抑制作用的测定参照Halder等［8］的方法，测定温度为25℃，酶反应总体积为 6 ml，包括:163 mg·L－1酶液 0.8 ml，0.8 mmol·L－1NADPH 1.0 ml，40 mmol·L－1DL-甘油醛 1.2 ml，2.0 ml的0.1 mol·L－1pH 6.2 磷酸钾缓冲液以及不同浓度种类的人参皂苷溶液。加入底物DL－甘油醛开始反应，以340 nm处每分钟NADPH吸光值的下降来表示AR的活性，每30 s测定1次，反应时间至少记录3 min。阳性对照为100 mg·L－1EPS，空白对照为重蒸水。样品对AR的抑制率按下面公式进行计算:

待测样品对AR抑制率/%=［1－(A2－A0)/(A1－A0)］×100%

式中A0:未加醛糖还原酶、底物和样品，即每分钟NADPH自然吸光值的下降。

A1:未加样品，加入醛糖还原酶、底物，每分钟NADPH吸光值的下降。

A2:加醛糖还原酶、底物和样品，每分钟NADPH吸光值的下降。

以样品浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制抑制曲线，依据动力学曲线计算其半数抑制浓度(IC50)。

1.2.3人参皂苷单体对AR抑制类型的测定选取抑制活性较高的提取物，测定其对AR的抑制类型。反应温度为25℃，酶反应总体积3 ml，包括:163 mg·L－1酶液 0.4 ml，0.8 mmol·L－1NADPH 0.5 ml，100 mg·L－1人参皂苷 Rb1、Rd、Rg1 和 Rg2 0.5、1.0 ml，然后分别加入 40 mmol·L－1DL-甘油醛 0.75、0.375、0.25、0.188、0.15 ml启动反应，记录每分钟NADPH吸光值的下降。采用双倒数作图法，确定抑制剂的抑制类型，根据米氏方程计算动力学常数。

1.2.4统计学处理采用SPSS 11.0统计软件进行分析，实验数据表示为±s。

2 结果

2.1牛眼睛醛糖还原酶含量测定结果牛血清蛋白标准曲线:Y=0.1059X+0.1593，相关系数:0.9991。经定量分析测得牛眼睛 AR浓度为361.463 mg·L－1。

2.2人参皂苷对醛糖还原酶抑制作用从Tab 1可以看出在100 mg·L－1浓度时，人参皂苷 Rb2、Rb3、Rc和Re对醛糖还原酶抑制率为负值，说明他们对醛糖还原酶没有抑制作用;而人参皂苷Rg1、Rg2、Rd和Rb1对醛糖还原酶抑制率为正值，说明他们对醛糖还原酶有抑制作用。另外从图1看出人参皂苷Rg1、Rg2、Rd和Rb1对AR的抑制作用随浓度的增加逐渐增强，与其浓度存在明显的剂量－效应关系。

Tab 2是将Fig 1数据依据动力学曲线计算半数抑制浓度。结合Fig 1和Tab 2可知人参皂苷对AR的抑制，半数抑制浓度超过EPS的是人参皂苷Rb1，低于 EPS的是 Rg1、Rg2、Rd。说明人参皂苷 Rd、Rg1和Rg2对AR的抑制作用强于EPS，而Rb1的抑制作用较弱。另外根据半数抑制浓度大小，可知人参皂苷对AR抑制从高到低顺序依次是人参皂苷Rg2、Rg1、Rd 和 Rb1。

Fig 1 Inhibitory effect of ginsenoside on AR

Tab 2 IC50values of ginsenoside on AR

2.3人参皂苷对AR的抑制类型选取对AR抑制活性超过EPS的人参皂苷Rd、Rg1和Rg2，采用双倒数作图法，测定其浓度分别为0.017和0.033 g·L－1时对AR的抑制类型，Fig 2可以看出，不同人参皂苷对AR的抑制作用随着底物浓度的增大，其抑制作用随之增强，为反竞争性抑制。

Fig 2 Inhibition type of ginsenoside on AR

3 讨论

治疗糖尿病并发症的药物中，目前市场销售的都是合成类AR抑制剂。合成类AR抑制剂的最大问题就是毒性反应。有研究资料报道［9－11］中草药提取物石榴皮多酚、丹参酮类化合物、黄芩苷等对AR有抑制作用，他们优点是毒性作用较低，但通常由于其水溶性较差，且相对合成类药物而言对AR的抑制活性较弱，因此临床使用也受到某种程度的限制。本研究的结果表明:人参皂苷Rb1、Rd、Rg1和Rg2对AR具有抑制作用，而人参皂苷Rb2、Rb3、Rc和Re的抑制作用不明显。半数抑制浓度的进一步分析表明，人参皂苷Rd、Rg1和Rg2对AR的抑制作用强于依帕司他，而Rb1的抑制作用较弱。说明人参皂苷Rg2、Rg1、Rd对AR具有较强的抑制作用，在糖尿病并发症治疗方面具有潜在的应用价值，而且其在治疗糖尿病方面具有毒性作用低的优点。

本研究发现对AR有抑制活性人参皂苷对AR抑制从高到低顺序依次是人参皂苷Rg2、Rg1、Rd和Rb1，这种差异可能与其结构不同有关。下面做一下简单分析:首先分析皂苷的种类，人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc和Rd苷元是20S－原人参二醇，人参皂苷Re、Rg1和Rg2苷元是20S－原人参三醇，从对AR抑制结果看出对AR抑制与苷元的种类无关;其次分析皂苷糖链的的种类，双糖链是人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re 和 Rg1，单糖链的是人参皂苷Rg2，试验结果发现人参皂苷Rg2对AR抑制能力最强，说明单糖链皂苷对AR抑制能力强;接下来分析皂苷糖链上糖的种类，有两种糖的皂苷是人参皂苷Rb2、Rb3、Rc、Re和 Rg2，有 1 种糖且是葡萄糖的是人参皂苷Rg1、Rd和Rb1，这3种皂苷对AR都有抑制作用，说明对AR的抑制与皂苷上糖链是否是葡萄糖有关。最后分析糖链葡萄糖的数量，人参皂苷Rg1糖链葡萄糖数量是2个，人参皂苷Rd糖链葡萄糖数量是3个，人参皂苷Rb1糖链葡萄糖数量是4个，本试验测定的结果发现这3种人参皂苷对AR抑制从高到底顺序依次是人参皂苷 Rg1、Rd和Rb1，说明人参皂苷糖链上葡萄糖的数量越多，对AR的抑制能力越差，故对AR的抑制与皂苷上葡萄糖的数量有关。

本研究发现人参皂苷Rg2、Rg1、Rd对AR的抑制作用均为反竞争性抑制，而EPS是一种可逆性非竞争型的醛糖还原酶抑制剂［12］。正常状态时体内葡萄糖主要经糖酵解通路后进入有氧或无氧途径进一步代谢，多元醇通路只是起到补充作用，在糖尿病高血糖状态时，糖酵解达到极限，多元醇通路的代谢明显加强，在正常情况下，细胞内的葡萄糖仅约5%进入多元醇通路，糖尿病状态下，该通路异常激活，约30%的葡萄糖进入此通路，多元醇通路的异常激活是糖尿病慢性并发症的重要发病机制之一。EPS作为ARI，可以特异性地阻断多元醇通路，有效干预糖尿病并发症的发生。而人参皂苷Rg2、Rg1、Rd抑制糖尿病并发症的作用机制是否跟EPS一样，其它人参皂苷是否具有抑制醛糖还原酶活性有待进一步研究。

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