噻吩-N-4甲基缩氨基硫脲及其银离子配合物对EC109增殖和凋亡影响

李晓娟，曹更生，刘广超，李明雪，张 洪

(河南大学1.生命科学院生物工程研究所、河南省重点学科动物转基因与细胞工程开放实验室，2.医学院、河南省天然药物与免疫工程重点实验室，3.化学化工学院分子与晶体工程研究所，河南 开封 475004)

缩氨基硫脲(N)及衍生物由于具有广泛的生物活性而备受人们的重视，尤其研究其抗肿瘤活性成为热点。研究发现，很多这类化合物物因含有N、S等杂原子和C=N 基团很容易与多种金属离子形成稳定的配合物，且形成配合物后生物活性明显不同。进一步的研究表明，在缩氨基硫脲化合物中，含有完整的=N1NH(CS)N4H-结构是缩氨基硫脲化合物具有生物活性的基本活性单元，而缩氨基硫脲中N(1)上醛酮的不同结构及N(4)上不同结构的活性基团，对其抗菌、抗病毒和抗肿瘤等多种生物活性的强弱将产生极大的影响［1－3］。本文合成了噻吩-N-4甲基缩氨基硫脲和新型化合物噻吩-N-4甲基缩氨基硫脲银(N-Ag)，并对其抗肿瘤生物活性进行体外评价，研究了噻吩-N-4甲基缩氨基硫脲银对食道癌细胞EC109凋亡的影响。为研发新合成的抗肿瘤药物提供参考。

1 材料

1.1仪器Mμltiskan Asent全自动酶标仪(美国Thermo公司);EPICSXL型流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司);XD-202型荧光倒置显微镜(南京江南永新光学有限公司);BHC-1300ⅡA2型生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司)。

1.2供试材料和试剂新型化合物噻吩-N-4甲基缩氨基硫脲和金属配合物噻吩-N-4甲基缩氨基硫脲银结构如下:

其粉剂溶于二甲亚砜。MTT、吖啶橙(AO)、台盼蓝、胰蛋白酶、碘化丙啶(PI)、RNA酶A(均来自Sigma公司)，AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物有限公司);DMEM培养基(美国Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青公司)。

1.3细胞食道癌细胞EC109(河南大学医学院提供)。

2 方法

2.1化合物的合成［4］配体2-噻吩甲醛-N(4)-甲基缩氨基硫脲的合成:4-甲基-3-氨基硫脲(0.44 g，4 mmol)和2-噻吩甲醛(0.45 g，2 mmol)置于盛有30 ml乙醇的烧瓶中，滴加5滴冰醋酸，搅拌回流2 h，抽滤，得到深棕色固体，其分子量为198。

2-噻吩甲醛-N(4)-甲基缩氨基硫脲合银的合成:将 AgNO3(0.35 g，2 mmol)和 2-噻吩甲醛-N(4)-甲基缩氨基硫脲(0.4 g，2 mmol)悬浮于50 ml乙醇溶剂中，立即变为深红色溶液，搅拌回流1 h后，冷却至室温，过滤，得红棕色晶体，其分子量为2129.31。

2.2细胞培养食道癌细胞EC109接种于含有10%新生牛血清的DMEM培养基中，5%CO2、37℃、饱和湿度下常规培养。

2.3细胞生长抑制测定

2.3.1增殖抑制率的测定取传代培养的对数生长期的EC109，制成1×108个·L－1的细胞悬液，接种于96孔细胞板中，每孔200 μl，隔夜孵育后分别加入药物N和N-Ag，两种药物浓度设置为8个浓度梯度，药物组 N 最大终浓度为157.83 μmol·L－1，药物组 N-Ag 的最大终浓度为 14.68 μmol·L－1，依次二倍稀释。每个剂量设置4个复孔，同时设置调零孔和对照孔。5%CO2、37℃、饱和湿度下培养48 h 后，加入20 μl 5 g·L－1的MTT。继续培养4 h 后，弃上清。加入150 μl DMSO，振荡后用酶标仪在波长为570 nm测吸光度，参考波长为630 nm。按照下列公式求出肿瘤细胞的生长抑制率(IR):IR=［1－(实验组平均吸光值－调零组平均吸光值)/(对照平均吸光值－调零组平均吸光值)］×100%。阴性对照组为不加药物等量的培养基。

2.3.2生长曲线的测定同样采用上述MTT比色法测定。分4组:阴性对照组(不加药物的培养基)、浓度为 39.50 μmol·L－1N 组、两个浓度 1.83 μmol·L－1(1)、3.67 μmol·L－1(2)N-Ag 组，分别不同时间处理EC109细胞，测定其对该细胞增殖抑制情况。

2.4细胞形态学分析

2.4.1吉姆萨染色取对数生长期EC109细胞接种于24孔板中，培养16 h后，随机分3组:药物组N(终浓度为 39.50 μmol·L－1)、药物组 N-Ag(终浓度为 3.67 μmol·L－1)、阴性对照组(不加药物的培养基)，培养 4、8、24 h 后吸去培养基，PBS 漂洗，体积分数0.70的甲醇固定，吉姆萨染液30 min，光镜下观察。

2.4.2荧光染色取对数生长期EC109细胞接种于24孔板中，培养16 h后，药物分3组处理细胞同2.4.1，培养4、8、24 h 后吸取培养基，PBS 漂洗，每孔加入90 μl的 PBS，10 μl的吖啶橙溶液，混匀放置5 min后在荧光显微镜观察细胞形态。

2.5流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分布

2.5.1AnnexinⅤ-FITC/PI双染收集不同浓度的N、N-Ag两种药物作用4 h的EC109细胞，细胞密度在1×108个·L－1以上，PBS洗2次，按照试剂盒说明书操作。流式细胞仪检测，激发波长488nm。2.5.2PI单染检测凋亡峰及细胞周期分布分别收集用浓度 3.67 μmol·L－1的 N-Ag 处理 4、8、12 h的EC109细胞1×109个·L－1以上，同时设置阴性对照组。PBS洗涤2次后用预冷的体积分数为0.70的酒精固定24 h以上，离心去固定液，PBS洗涤2～3次后重悬于0.5 ml含100 mg·L－1PI和100 mg·L－1RNaseA的染液中，4℃下避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期变化。细胞凋亡率用APO(%)表示。见Tab 1。

Tab 1 Effect of medicine N-Ag on cell cycle distribution and apoptosis of EC109 cells

2.6统计学方法采用Origin7.0软件进行统计学检验。实验结果以±s表示，采用ANOVO单因素方差分析。

3 结果

3.1噻吩-N-4甲基缩氨基硫脲(N)及其过渡金属配合物噻吩-N-4甲基缩氨基硫脲银(N-Ag)体外对食道癌细胞EC109增殖的抑制作用

3.1.1如Fig 1(A)所示，不同浓度的两种药物N、N-Ag分别处理食道癌细胞EC109 48 h后，N-Ag对食道癌细胞EC109增殖的抑制作用明显。在药物N-Ag浓度 0.92 ～14.68 μmol·L－1范围内，随着剂量的增加，抑制率也增加，有显著的量效关系;而其配体N对细胞增殖的影响相对不明显，差异没有显著性，抑制率在0.1～0.2左右(P＜0.05)。

3.1.2生长曲线的测定如Fig 1(B)所示，浓度为39.50 μmol·L－1配体 N 处理 EC109 细胞，随着时间的延长，并不呈现时间依赖性;药物组N-Ag(1)和(2)在4 h就出现较高的抑制率，分别为0.392±0.085和0.522±0.064，且随时间延长，抑制率稳定上升，有明显的时间依赖性(P＜0.05)。

3.2噻吩-N-4甲基缩氨基硫脲及其过渡金属配合物噻吩-N-4甲基缩氨基硫脲银对细胞EC109的形态学影响

3.2.1吉姆萨染色如Fig 2所示，两种药物处理4 h后，加药组N中的EC109细胞生长良好，加药组N-Ag中的EC109出现细胞变圆漂浮，细胞核皱缩、染色加深、胞膜出现小泡等特征。

3.2.2荧光染色荧光显微镜观察细胞形态变化见Fig 3。对照组细胞结构清晰，胞质较丰富，呈均匀的橘黄色或黄绿色荧光，核大呈黄色或黄绿色均匀荧光。药物N处理的EC109细胞在不同时间均生长良好，形态同正常细胞，药物 N-Ag处理的EC109 细胞在浓度3.67 μmol·L－14 h出现细胞核致密浓染，固缩成新月状，细胞表面出现凋亡小体状小泡，有的细胞荧光染色减弱或消失呈坏死症状。

3.3流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分布

3.3.1AnnexinⅤ-FITC/PI检测细胞凋亡情况分析

药物N-Ag随着剂量的加大，发生凋亡的数目增多;如 Fig 4 中，C，D 为浓度为 1.83 μmol·L－1和3.67 μmol·L－1的药物 N-Ag，其早期凋亡率分别为4.95%和11.63%。与对照组 A(早期凋亡率1.11%)相比，差异有显著性(P＜0.05﹚，B为药物组 N(39.50 μmol·L－1)早期凋亡仅为 2.3%。

Fig 1 Inhibitory effect of medicines N and N-Ag on the proliferation of EC109

Fig 2 Morphological changes of EC109 cells observed by Giemsa staining(×400)

Fig 3 Morphological changes of EC109 cells observed by AO fluorescence Staining(×400)

Fig 4 Effect of medicines N and N-Ag on early apoptosis of EC109 cells by flow cytometry

3.3.2PI单染检测细胞凋亡及细胞周期分布结果见Tab 1。从Tab 1看出，与阴性对照组同时间段相比，药物N-Ag组的G0/G1时期细胞增加，S期变化不明显，G2/M时期细胞同比下降。加药组细胞周期被阻滞于G0/G1期。凋亡量随时间增加而增加，但是无明显凋亡峰出现。

4 讨论

本研究表明，噻吩-N-4甲基缩氨基硫脲(N)及其过渡金属配合物噻吩-N-4甲基缩氨基硫脲银(NAg)对食道癌EC109细胞在体外的生长抑制作用不同。在一定的范围内，N-Ag对食道癌EC109细胞生长抑制作用，随药物浓度增加或作用时间延长而增强，成明显量效和时效关系。起效浓度低，IC50值仅为2.24 μmol·L－1。与此对应的是，配体N却没有对食道癌EC109细胞在体外的生长有明显的抑制作用。显然，Ag+的络合是药物活性改变的关键。这与以前的工作［4］，药物对肝癌细胞SMMC7721的生长抑制作用的研究结果是一致的。

在探究药物抗肿瘤细胞的机制方面，被大家认可的是，能否引起肿瘤细胞凋亡已成为评价抗癌药物的一项重要指标［5］。我们在对N-Ag诱导食道癌EC109细胞凋亡研究中发现，在一定范围内，药物浓度越大，细胞凋亡出现的越早。N-Ag终浓度为3.67 μmol·L－1，药物作用 4 h，通过吉姆萨、荧光染色法分别清晰观察到食道癌EC109细胞凋亡小体的出现。与此对应，却没有观察到配体N诱导产生细胞凋亡小体。进一步通过流式细胞仪检测表明，N-Ag主要诱导食道癌EC109细胞早期凋亡，药物浓度过大容易导致细胞坏死。细胞周期分布研究表明，凋亡细胞大都被阻滞于G0/G1期。已有的文献报道，药物诱导的凋亡细胞受阻于G0/G1期不能进入S期［6］或细胞周期阻滞于 G2/M 而引发凋亡［7］。药物N-Ag可能是通过阻滞细胞周期而引发细胞凋亡的。

近期细胞凋亡的研究表明，细胞凋亡与一些调节分子活性有关，如下调 Survivin表达和提高Caspase-3活性［8］等。N 与 Ag+络合成 N-Ag，分子组成、结构发生变化的同时，抗肿瘤细胞活性如何产生，或许是一个有趣的课题;N-Ag如何与引起细胞凋亡的调节分子相互作用的研究，或许是需要进一步研究的内容。

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