针刺对胃肠平滑肌收缩粗肌丝调节机制的影响

邓晶晶,袁青



针刺对胃肠平滑肌收缩粗肌丝调节机制的影响

邓晶晶1,袁青2

(1.广州市第八人民医院中西医科,广州 510060;2.广州中医药大学针灸推拿学院,广州 510405)

观察针刺对胃肠平滑肌收缩粗肌丝调节机制的影响,并分析此影响与针刺调整胃肠动力的关系。将30只SD大鼠随机分为空白组、模型组(行结肠吻合术)和针刺组,每组10只。针刺组予每日针刺双侧足三针(足三里、三阴交、太冲),连续3 d。观察各组大鼠小肠推进率、核扫描胃液相排空实验,取结肠组织检测钙调蛋白mRNA表达、肌球蛋白轻链激酶表达、平滑肌肌动蛋白表达的变化。针刺组小肠推进率、胃半排时间和排空率较模型组有所改善(＜0.01,＜0.05)。各组钙调蛋白mRNA表达未见显著性差异。结肠平滑肌肌球蛋白轻链激酶表达和平滑肌肌动蛋白表达空白组最高,模型组明显下降,而针刺组较模型组有所上升(＜0.05)。针刺促进术后胃肠动力的恢复可能与提高平滑肌收缩粗肌丝调节机制中的平滑肌肌球蛋白轻链激酶表达和平滑肌肌动蛋白表达有关,与钙调蛋白mRNA表达无关。

针刺;钙调蛋白;大鼠;肌球蛋白轻链激酶

平滑肌收缩装置是一个收缩蛋白质体系,依其功能分为收缩蛋白质(肌球蛋白、肌动蛋白)、调节蛋白质(钙调蛋白、肌球蛋白轻链激酶、肌球蛋白轻链磷酸酶、原肌球蛋白)和细胞骨架蛋白质(结蛋白、波形蛋白)。现今公认的调节平滑肌收缩的经典机制为粗肌丝相关调节机制,又称为Ca2＋-钙调蛋白-肌球蛋白轻链激酶依赖的机制[1]。主要机制为在Ca2＋的参与下,肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)催化肌球蛋白轻链(20kD myosin light chains,MLC20)磷酸化,磷酸化的肌球蛋白分解足够的ATP,通过与肌动蛋白的相互作用而产生收缩。

腹部术后由于受到手术麻醉创伤,术后禁食镇痛、腹腔内积血或引流管的机械刺激等综合因素的作用,胃肠平滑肌的收缩功能常常出现紊乱,表现为术后腹胀腹痛,恶心呕吐,排气排便困难或腹泻等胃肠运动功能障碍的一系列症状。针刺用于促进术后胃肠运动功能的恢复在临床上已经取得一定成效[2-4],但其作用机理尚未明确。本研究从调节平滑肌收缩的粗肌丝相关机制着手,探讨针刺对其影响,分析此影响与针刺调整胃肠动力的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

99mTc-DTPA(北京原子高科公司提供,放化纯＞95%);Rabbit anti-MLCK(北京博奥森生物技术有限公司提供),anti-SMA和即用型SABC兔IgG免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司提供);Trizol和RNA提取液、MMLV、Taq酶、dNTPs(达安生物工程有限公司提供);3900台式高通量DNA合成仪、9700 PCR仪、7500全自动荧光定量PCR仪(美国ABI公司提供);HC-3018R高速冷冻离心机(安徽科大创新公司提供);－80℃冰箱(日本Sanyo公司提供);Varicam型双探头可变角度单光子发射型计算机断层显像仪(SPECT),配平行孔低能高分辨型准直器(以色列Elscimt公司提供);2135病理切片机(德国Leika公司提供);光学显微镜(日本Olympus公司提供)。

1.2 动物分组及模型制备

SPF级健康SD大鼠30只,雌雄各半,体重250～300 g,由广州中医药大学动物实验中心提供(0055935)。按完全随机法将其分为针刺组、模型组、空白组,每组10只。

肠肠吻合模型制备具体操作为,术前禁食禁饮12 h,10%水合氯醛腹腔注射麻醉(剂量为0.33 mL/ 100 g)。仰卧位固定,常规备皮、消毒,下腹正中切口,长约2 cm;寻找到大鼠盲肠下2 cm处结肠,切断后行原位缝合(一层缝合法);关腹。手术当天禁食禁饮水,术后第1、2天流质饮食,第3天核扫描后予标准鼠料,控制食量,按l6～20 g/(只·d)的1/3量供给,术后第4天处死检测指标。

1.3 穴位定位与针刺方法

取足三针,即双侧足三里、三阴交、太冲,定位参考《实验针灸学》。针刺组动物术后清醒即予针刺,采用0.18 mm×10 mm毫针直刺入穴位,每5 min缓慢提插捻转2～3次,每日针刺1次,每次15 min。模型组、空白组每天同一时间放于固定器中15 min。疗程为3 d。

1.4 核素扫描胃液相排空试验

术后第3天检查前将大鼠禁食12 h,用安定4 mg/ kg行腹腔注射。予液体试验餐灌胃(液体试验餐由99mTc-DTPA和0.9%NS混合配制,灌胃剂量为1.5 mL试验餐/只,内含0.1～0.2 mCi99mTc-DTPA)。将大鼠置入圆筒固定器,采用大鼠立位将圆筒固定器放置于检测床上,调整低能通用型准直器的探头视野中心置于大鼠腹部,动态连续采集,能峰160 keV,窗宽20,矩阵256×256,Zoom(放大倍数)1.0,采集时间20 s/帧,共60 min。用计算机软件(GASTRICEMPTYING)处理后获得胃排空-时间曲线,通过曲线找出相对应的胃半排时间(GET1/2),并计算胃60 min排空率。胃排空率=(总放射性-t时胃内放射性K)/总放射性×100%。K为从时间0至t时的放射性衰变校正系数(此过程计算机自动处理)。

1.5 小肠推进率的测定

碳素墨水予大鼠灌胃1 mL/只,30 min后处死,用米尺测量小肠全长(幽门至回盲部)以及标记物在小肠从幽门向前推进的距离(从幽门至炭末前沿的长度)。计算标记物推进的距离占小肠全长的百分比。

1.6 钙调蛋白(calmodulin,CaM)mRNA的测定

取盲肠下2 cm处结肠(相当吻合口处)组织100 mg,充分研磨,TRIzol(Gibco BRL,USA)一步法提取组织总RNA。取RNA模板逆转录合成cDNA,37℃1 h,然后95℃逆转录反应灭活3 min。取逆转录产物加入PCR扩增反应体系中,93℃3 min,然后93℃30 s,55℃45 s,72℃45 s,共40循环。CaM1(扩增片段长度102 bp)的引物序列:5’-GACTGTCATGCGGTCACTGG-3’(上游), Reverse Primer为5’-TCTGGGAAGTCAATGGTGCC-3’ (下游)。内参基因R-GAPDH(扩增片段长度134 bp)的引物序列为5’-TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT-3’(上游),5’-CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC-3’(下游)。由电脑自动分析并计算结果(拷贝数/mL cDNA)。考虑到各个样本总RNA浓度的差异,按下列公式换算,A=B1(目的基因)/B2(内参基因)。

1.7 肌球蛋白轻链激酶和平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)表达的测定

①取盲肠下2 cm处结肠(相当吻合口处),去除内容物,PBS漂洗,于10%福尔马林中固定。②包埋,切片,脱蜡,梯度乙醇水化,加3%H2O2灭活内源性过氧化酶,用柠檬酸行抗原修复,滴加5%BSA封闭液室温20 min,加一抗恒温箱1 h,PBS漂洗后加二抗室温20 min,PBS漂洗后加SABC液室温20 min,PBS漂洗后DAB显色,苏木素复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,树胶封片,阅片,照相。③相对表达量分析。对肌球蛋白轻链激酶表达采用分级判断方法,(－)为无染色信号;(＋)为染色信号呈细颗粒状,色棕黄,阳性细胞占总细胞数＜50%;(＋＋)为染色信号呈细颗粒状,色棕黄,阳性细胞占总细胞数＞50%;(＋＋＋)为染色信号呈粗颗粒状或块状,色棕黑,阳性细胞占总细胞数＜50%;(＋＋＋＋)为染色信号呈粗颗粒状或块状,色棕黑,阳性细胞占总细胞数＞50%。对平滑肌肌动蛋白表达使用EIG综合图像分析软件处理,用亮度值表示染色深浅,范围值由0(深)～255 (浅)。每张切片均随机选取3个视野,计算其平均亮度值。

1.8 统计学方法

统计数据均采用SPSS16.0统计软件进行统计学处理。计量资料采用检验,计数资料比较用卡方检验。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组胃半排时间与60 min排空率比较

由表1可见,模型组胃半排时间、60 min排空率与空白组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。针刺组胃半排时间、60 min排空率与模型组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01),提示针刺能促进胃排空加快。针刺组胃半排时间、60 min排空率与空白组比较,差异无统计学意义(＞0.05),提示术后3 d,在针刺作用下胃排空功能基本恢复正常。

表1 三组胃半排时间与60 min排空率比较 (±s)

注:与模型组比较1)＜0.01;与空白组比较2)＜0.05

2.2 小肠推进率

由表2可见,模型组小肠推进率与针刺组和空白组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。针刺组小肠推进率与空白组比较,差异无统计学意义(＞0.05),表明针刺治疗能提高小肠推进率。

表2 三组小肠推进率比较 (±s)

注:与模型组比较1)＜0.05;与空白组比较2)＜0.05

2.3 三组钙调蛋白mRNA含量比较

针刺组、模型组和空白组胃肠组织CaM1 mRNA含量分别为(0.055±0.03)、(0.034±0.04)和(0.034±0.03),组间比较差异均无统计学意义(＞0.05),提示针刺调整术后胃肠平滑肌收缩粗肌丝调节可能不是主要通过改变胃肠组织的CaM1 mRNA含量而实现。

2.4 三组肌球蛋白轻链激酶的表达

空白组结肠平滑肌MLCK表达阳性颗粒数量较多,色棕黄,达到(＋＋),模型组阳性颗粒数量明显减少,染色较浅,密度降低,分布稀疏,甚至消失,为(－～＋),而针刺组阳性颗粒较模型组在数量、密度和染色程度方面均有所上升,为(＋＋)。详见图1。

图1 结肠组织MLCK表达的免疫组化染色(SABC-DAB法,×200)

2.5 三组平滑肌肌动蛋白的表达

空白组结肠组织肌动蛋白表达阳性颗粒呈粗颗粒状,深棕色,数量较多,灰度值为(90.33±0.18);模型组为阳性颗粒显著减少甚至消失,灰度值为(192.11±0.23);针刺组阳性颗粒数量较模型组有所增加,分布较为稀疏,着色程度不如空白组,灰度值为(125.06±0.12)。与空白组比较,模型组结肠组织肌动蛋白含量术后明显下降(检验,＜0.05),而针刺组较模型组有所上升(检验,＜0.05)。详见图2。

图2 结肠组织SMA免疫组化染色(SABC-DAB法,×200)

3 讨论

Ca2＋是细胞信号转导系统中重要的第二信使物质,Ca2＋浓度的变化引起钙调蛋白(CaM)构象和活性的变化,进一步激活含CaM结合位点的靶蛋白——Ca2＋/CaM依赖性蛋白激酶(Ca2＋/calmodulin dependent protein kinases,CaM Ks)和Ca2＋/CaM依赖性蛋白磷酸酶。CaMKs属于丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶家族,肌球蛋白轻链激酶(MLCK)为其中一员。磷酸化酶激酶使磷酸化酶发生磷酸化,从而调节体内物质代谢。

肌球蛋白磷酸化学说认为[5-9],肌肉处于静息态时,细胞内游离钙浓度为0.2mmol/L,肌球蛋白轻链激酶(MLCK)分子折叠,催化域与“伪底物域”结合,呈非活性酶,肌球蛋白20kD轻链(MLC20)不能发生磷酸化,肌球蛋白与肌动蛋白无反应。当肌肉接受刺激发生兴奋时,胞外钙离子内流和肌浆网钙离子释放,细胞内游离钙浓度上升为0.6mmol/L,Ca2＋即与CaM结合进而结合于MLCK成为三元体,使MLCK发生构象变化而活化呈活性酶,催化MLC20的19位丝氨酸磷酸化,增加了肌球蛋白头部的ATP酶活性,导致Mg2＋-ATP分解,由此产生的磷酸基结合于横桥使其处于高自由能状态,启动横桥循环,粗、细肌丝相互滑动,肌肉收缩。

粗肌丝是组成肌节的肌球蛋白丝,而肌动蛋白丝则是构成细肌丝的核心。肌动蛋白丝又称纤维状肌动蛋白,为ATP驱动的肌球蛋白提供运动轨道,传递张力,在细胞收缩、运动中起重要作用。故平滑肌肌动蛋白含量对平滑肌的收缩能力具有较大影响[10]。

本研究对胃肠平滑肌收缩粗肌丝调节机制的重要分子如钙调蛋白、肌球蛋白轻链激酶和肌动蛋白进行了测定。结果提示,钙调蛋白mRNA在空白组、模型组和针刺组间没有明显改变。而平滑肌肌球蛋白轻链激酶(MLCK)表达和平滑肌肌动蛋白(SMA)表达在结肠术后均有所下降(模型组与空白组比较,＜0.05),针刺能提高其表达(针刺组与模型组比较,＜0.05)。且MLCK和SMA表达增多的针刺组其小肠推进率和核素扫描胃排空实验的结果均好于模型组(＜0.05,＜0.01),与空白组无显著性差异(＞0.05)。故由此可以推断,针刺促进术后胃肠动力的恢复可能与其提高结肠平滑肌肌球蛋白轻链激酶表达和平滑肌肌动蛋白表达有关,与钙调蛋白mRNA表达无关。

[1] 陈明,李爱媛.肌肉肌球蛋白,粗肌丝和Ca2＋调节机制的多样性[J].生理科学进展,1993,24(1):6-9.

[2] 宋建乔.针刺促进腹部手术后胃肠功能恢复的临床观察[J].河北中医,2009,31(2):288,292.

[3] 周艳玲,张金成,黄锦萍.穴位低频电刺激与穴位针刺对肠梗阻手术后胃肠蠕动功能影响的比较[J].现代中西医结合杂志,2010,19 (18):2269,2274.

[4] 陈捷,孙立明,马尚伟.针刺治疗胆囊结石术后胃肠功能紊乱临床观察[J].上海针灸杂志,2010,29(5):298-299.

[5] De Lanerolle P, Paul RJ. Myosin phosphorylation dephosphorylation and regulation of airway smooth muscle contractility[J]. Am J Physiol, 1991,261(2pt1):1-14.

[6] 陈明,李爱媛.平滑肌肌球蛋白B的超沉淀与调节轻链磷酸化[J].生物化学杂志,1992,8(4):424-428.

[7] Kamm KE, Stull JT. Myosin phosphorylation,force,and maximal shortening velocity in neurally stimulated tracheal smooth muscle[J]. Am J Physiol, 1985,249(3pt1):238-247.

[8] Kamm KE, Stull JT. The function of myosin and myosin light chain kinase phosphorylation in smooth muscle[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1985,25:593-620.

[9] Vale RD, Milligan RA. The way things move: looking under the hood of molecular motor proteins[J]. Science, 2000,288(5463):88-95.

[10] Halayko AJ, Salari H, MA X,. Marker of airway smooth muscle cell phenotype[J]. Am J Physiol, 1996,270(6Pt1):1040-1051.

Effect of Acupuncture on the Mechanism of Regulation of Thick Filaments During Gastrointestinal Smooth Muscle Contraction

-1,2.

1.,8’,510060,; 2.-,510405,

To investigate the effect of acupuncture on the mechanism of regulation of thick filaments during gastrointestinal smooth muscle contraction and analyze the relationship between the effect and acupuncture regulation of gastrointestinal motility.Thirty SD rats were randomly allocated to blank, model (colonic anastomosis was performed) and acupuncture groups, 10 rats each. In the acupuncture group, bilateral three leg points (Zusanli, Sanyinjiao and Taichong) were needled every day for three consecutive days. The intestinal propulsion rate was examinedand nuclear liquid phase gastric emptying scanwas taken in each group of rats. The colonic tissue was taken to examine the expressions of calmodulin mRNA, myosin light chain kinase and smooth muscle actin.The intestinal propulsion rate, and the gastric emptying half timeand emptying rate improved somewhat in the acupuncture group compared with the model group. There was no significant difference in the expression of calmodulin mRNA between the groups. The expressions of myosin light chain kinase and actin of colonic smooth muscles were highest in the blank group, decreased markedly in the model group and increased somewhat in the acupuncture group compared with the model group.That acupuncture promotes the postoperative recovery of gastrointestinal motility may be related to the expressions of smooth muscle myosin light chain kinase and actinin improving the mechanism of regulation of thick filaments during smooth muscle contraction and not related to the expression of calmodulin mRNA.

Acupuncture; Calmodulin; Rat; Myosin light chain kinase

1005-0957(2011)11-0783-04

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2011.11.783

2011-02-23

邓晶晶(1982 - ),女,医师,博士