β－葡聚糖酶对β－1，3－葡聚糖的最佳酶解条件

张 岩，高世勇，季宇彬

(1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076;2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨 150076)

酵母β－1，3－葡聚糖是一种抗细菌、抗真菌、增强免疫活力、毒副作用低、生物活性强的高效生物应答物［1］，而且 β－1，3－葡聚糖在医学上还可用于预防和治疗癌症、免疫缺陷等疾病［2］.多糖发挥生物活性的首要条件是将多糖溶于水中，但酵母β－1，3－葡聚糖水溶性又很低;100～200 ku分子量的高分子多糖表现出较强的生物活性，但其水溶性均比较差，而可溶性多糖如能基本保留大分子的生物活性，那么分子质量大都大于10 ku［3］.分子质量的大小和水溶性的强弱对抗肿瘤活性的表达都有一定的影响［4］.β－1，3－葡聚糖经酶水解后可改善其水溶性，提高其利用率.因为β－1，3－葡聚糖经酶水解后多聚糖苷键断裂，葡聚糖降解为还原糖或寡糖，其分子质量减小，聚合度降低，从而提高其水溶性［5］.β－葡聚糖酶含外切 β－1，3－葡聚糖酶和内切β－1，3－葡聚糖酶，它们都可以将β－1，3－葡聚糖水解，从而使分子质量降低.酶的活性又受多种因素的影响，如酶质量浓度、底物质量浓度、温度、pH值.为使酶发挥最大活性，就要先了解β－葡聚糖酶的最佳酶解条件.因此本文从β－1，3－葡聚糖被降解为还原糖的得率大小观察β－葡聚糖酶的最佳酶解条件.

1 材料与仪器

1.1 药品

β－1，3－葡聚糖(宜兴市德圣化工有限公司);β－葡聚糖酶(由湖州礼来生物技术有限公司).

1.2 试剂

酒石酸钾钠(哈尔滨市化工试剂厂);3，5－二硝基水杨酸(天津市光复精细化工研究所);氢氧化钠(天津市大陆化学试剂厂);苯酚(天津市光复精细化工研究所);无水亚硫酸钠(哈尔滨市化工试剂厂);醋酸钠(天津市百世化工有限公司);醋酸(天津市耀华化学试剂有限公司);无水葡萄糖(上海化学试剂采财供应端经销).

1.3 仪器

分析天平(奥豪斯国际贸易有限公司);S－25 pH计(上海雷磁仪器厂);752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);W201数控恒温水浴锅(上海申胜生物技术有限公司);DK2电热恒温振荡水槽(上海恒科技有限公司).

1.4 试剂的配置

1.4.1 DNS 溶液的配置

称取酒石酸钾钠182.0 g，溶于500mL的单蒸水中(不断的搅动并加热，温度不超过50℃)，按顺序加入 3，5－二硝基水杨酸 6.3 g，262mL 2 mol/L的氢氧化钠溶液，水浴溶解.再加入苯酚5.0 g和无水亚硫酸钠5.0 g，充分搅拌溶解，冷却后用水定溶至1000mL.储存于棕色瓶并放置冰箱中，7 d后方可使用.

1.4.2 醋酸－醋酸钠缓冲溶液

取醋酸钠54.6mg，加1 mol/L醋酸溶液20mL溶解后，加水定容至500mL，即 pH值为6.0.利用pH计的数值大小来相应的加醋酸钠或醋酸溶液，达到所需pH值.

2 实验方法

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

精密称取105℃下恒重的无水葡萄糖标准品0.1000 g溶于100mL蒸馏水，配置成1mg/mL的葡萄糖溶液.准备20mL试管30支，做3个平行，编号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10.分别吸取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL，加入试管中，用单蒸水补加到1.0mL.然后加入2mL DNS溶液，震荡混匀于沸水中煮5min，冷却后加入9mL蒸馏水稀释混匀，用空白调零点，于540 nm处测定吸光度值，记录OD540，绘制出标准曲线(以葡萄糖质量浓度为横坐标，以OD540为纵坐标)［6］.

2.2 酶活力测定

加入0.5mL β－1，3－葡聚糖溶液，50 ℃预热10min，加入 0.1mL β－葡聚糖酶溶液，并在空白样补加灭活的酶0.1mL，补加单蒸水0.4mL，混匀后反应10min加入2mL DNS溶液，煮沸5min.在540 nm下测定OD值［6］.(酶活单位定义在上述测定条件下，每分钟从底物溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为1个酶活单位，简称U).稀释后的酶液OD540在0.2～0.5之间为宜.

2.3 糖质量浓度对酶活性的影响

向各个试管中依次加入 0.2、0.8、1.4、1.6、1.8、2、2.4、3、3.6、4mg/mL 糖溶液 0.5mL，预热到50℃，加稀释后的酶液0.1mL，pH值为中性的缓冲液0.4mL(三个平行组)，50℃水浴10min，用DNS中止反应，煮沸5min;做空白对照，取灭活的酶 0.1mL、加单蒸水 0.5mL、缓冲溶液 0.4mL.冷却后加9mL单蒸水，在540 nm下，测还原性糖质量浓度.

2.4 酶质量浓度对酶活性的影响

取一定质量浓度的糖溶液0.5mL，预热到50℃，向各个试管中依次加入 0.5、1、6、10、14、18、20、25、30mg/mL 酶液 0.1mL，pH 值为中性的缓冲液0.4mL(三个平行组)，50℃水浴10min，用DNS中止反应，煮沸5min;做空白对照，取糖溶液0.5mL、加单蒸水 0.1mL 和缓冲溶液 0.4mL.冷却后加9mL单蒸水，在540 nm下，测还原性糖质量浓度.

2.5 温度对酶活性的影响

取稀释后的酶液0.1mL，预热到50℃，加入一定质量浓度的糖溶液0.5mL，加pH为中性的缓冲液0.4mL(三个平行组)，分别在 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃下水浴10min，用 DNS 中止反应，煮沸5min;做空白对照，取灭活的酶0.1mL、糖溶液0.5mL 和缓冲溶液 0.4mL.冷却后加9mL单蒸水，在540 nm下，测还原性糖质量浓度.

2.6 pH值对酶活性的影响

取稀释后的酶液0.1mL，预热到50℃，加入一定质量浓度的糖溶液0.5mL，向各个试管中依次加入 pH 值为 3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5缓冲液0.4mL(三个平行组)，50℃水浴10min，用DNS中止反应，煮沸5min;做空白对照，取灭活的酶 0.1mL、糖溶液0.5mL 和单蒸水 0.4mL.冷却后加9mL单蒸水，在540 nm下，测还原性糖质量分数.

2.7 时间对酶活性的影响

取一定质量浓度的酶和糖溶液在固定温度下反应 1、5、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180min(3个平行组)在540 nm下的OD值，测还原性糖质量浓度.

3 实验结果

3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

见表1.

表1 葡萄糖标准曲线表

以吸光度为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，得到葡萄糖标准曲线，如图1所示，经回归处理得到线性方程 y=1.2095x+0.005(r=0.9995)线性范围:0 ～0.9mg/mL.

图1 葡萄糖标准曲线

3.2 底物中糖质量浓度对酶解产物还原性糖得率的影响

在β－葡聚糖酶的作用下，β－1，3－葡聚糖糖苷键断裂，降解为寡糖或还原性糖.从图2中得出，最适底物质量浓度范围为1.4～1.8mg/mL，此时还原性糖质量分数较高;最适的底物质量浓度为1.6mg/mL，此时还原性糖质量分数达到最大.最初随底物质量分数增加，还原性糖质量分数增加;增加到一定程度，随底物质量浓度继续增加，曲线又呈下降趋势.曲线下降主要是因为底物质量浓度增大的同时，反应体系的黏度也在增大，阻碍了底物与酶的接触;或者是酶量一定时，底物达到饱和.

图2 糖质量浓度对酶解产物还原性糖得率的影响

3.3 酶质量浓度对酶解产物还原性糖得率的影响

从图3中得出，最适酶质量浓度范围为6～14mg/mL，此时还原性糖的质量分数呈增加趋势并且逐渐减小;但当酶质量浓度为10mg/mL时，还原性糖质量分数增加幅度最小，并逐渐趋于平衡.主要因为开始酶质量浓度小，底物没有完全降解，而增加到一定程度时底物经酶作用趋于完全降解.

图3 酶质量浓度对酶解产物还原性糖得率的影响

3.4 温度对酶解产物还原性糖得率的影响

图4 温度对酶解产物还原性糖得率的影响

从图4中得出，最适温度范围为45～55℃时，还原性糖质量分数较高;最适的温度为50℃，此时还原性糖质量分数达到最大.最初随温度增加，还原性糖质量分数增大，说明酶活增大;温度增加到一定温度，超过酶的活性范围时，对酶有破坏作用，还原性糖质量分数降低，酶活减小.

3.5 pH值对酶解产物还原性糖质量分数的影响

从图5中得出，最适pH范围为5～6时，还原性糖质量分数较高;最适pH值为5.5时，还原性糖质量分数最大.其下降的趋势主要由于pH值超过酶活性范围时，pH改变了酶的空间结构，从而使酶活性降低.

图5 pH值对酶解产物还原性糖质量分数的影响

3.6 β－葡聚糖酶酶解的条件优化

为了使反应条件达到最佳，得到最大的还原性糖质量分数，在以上单因素的基础上，以底物中糖质量浓度、酶质量浓度、温度、pH值为试验因素，进行四因素三水平的正交试验，表2为正交试验结果及分析，表3为方差分析结果.

表2 正交试验结果及分析

表3 方差分析结果

从表2、3中可以看出，底物中糖质量浓度的各水平间的差异极显著，酶质量浓度和温度各水平间的差异显著，而相对来说温度次之，pH值影响最小.综合各因素对还原性糖质量分数的影响，最优组合为A1B3C3D2，即反应体系中糖质量浓度为1.4mg/mL，酶质量浓度为14mg/mL，反应温度为55℃，反应pH值为5.5，还原性糖质量分数为95.30%.

3.7 酶解时间对酶解产物还原性糖得率的影响

在糖质量浓度为1.4mg/mL，酶质量浓度为14mg/mL，反应温度为55℃，反应pH值为5.5的条件下，研究不同水解时间对还原性糖质量分数的影响，如图6所示.反应时间对酶活力有一定的影响，反应时间为1min时，由于时间太短，底物与酶没有充分接触，还原性糖质量分数较小;随着时间的增加还原性糖质量分数增加;反应时间从10min开始，还原性糖质量分数趋于平衡，随着时间的延长，还原性糖质量分数逐渐趋于平衡.

图6 酶解时间对还原性糖质量分数的影响

4 讨论

β－葡聚糖酶(β－glucanase)是一类水解酶，包含了所有能分解β－糖苷键连接的葡萄糖聚合物的酶系.β－葡聚糖酶主要来源于微生物和植物，但人和动物体内缺乏［7］.其不但降低底物的聚合度，而且不改变糖的天然结构，不会影响或降低其生物活性［8］.由于作用方式不同，β－葡聚糖酶可分成外切和内切，如外切β－1，3－葡聚糖酶、外切β－1，4－葡聚糖酶、内切 β－1，3－葡聚糖酶、内切β－1，4－葡聚糖酶［9］.β－葡聚糖酶［10］由于可以降解β－葡聚糖分子中的β－1，4和β－1，3糖苷键，使其降解为小分子量片段，失去黏性和亲水性，使单胃动物肠道中内容物的特性、肠道微生物的作用环境、消化酶的活性等发生变化，而利于营养物质在动物体内的消化和吸收，加快生长性能以及粮食的转化率.目前β－葡聚糖酶在各领域发挥着巨大的作用，如饲料、纺织、造纸、食品、日化等［11］.

酶是由细胞产生的具有催化能力的蛋白质.酶反应的优点是不改变其结构，反应条件温和，对生物活性影响小，无毒副作用，应用广泛.其又具有显著的特点，如高度专一性、较高催化效率以及可调控的酶活性等［12］.但酶法降解对试验的条件要求比较高，为了使酶发挥更大的作用，就要先确定底物质量浓度、最适温度、pH值、酶质量浓度、最适时间等条件［13］.

我国有十分丰富的酵母资源，年产万吨的酵母泥，我国对其没有很好的重视和利用，而作为廉价饲料或作为废物丢弃，既造成资源浪费又造成环境污染［14］.对酵母废泥充分开发利用，使其中较丰富的β－1，3－葡聚糖被充分利用，如β－1，3－葡聚糖被降解后产生的寡糖不论从溶解性还是生物活性角度比较均优于多糖，利用酶将β－1，3－葡聚糖降解为寡糖，可以开发出价值较高的寡糖产品［15］，提高 β－1，3－葡聚糖的利用率，而且有极大的经济效益.

β－葡聚糖酶对β－1，3－葡聚糖的降解作用，酶的活性受多种因素的影响.本文从底物质量浓度、酶质量浓度、最适温度以及pH值为单因素对酶解后的产物中还原性糖得率的影响，得出最适条件.在此基础上进行四因素三水平的正交试验，优化酶解条件，以期得到得率最大的还原性葡聚糖.最佳条件确立后，进而研究酶解时间.

实验结果表明，β－1，3－葡聚糖质量浓度为1.4mg/mL，β－葡聚糖酶质量浓度为 14mg/mL，反应温度为55℃，反应pH值为5.5，反应10min，还原性糖得率最大，为95.30%.本文的研究内容为提高β－1，3－葡聚糖的利用价值提供了依据.

［1］KOGAN G.(1→3，1→6)－β－D－Glucans of yeasts and fungi and their biological activity［J］.Studies in Natural Products Chemistry，2000，23:107－152.

［2］郭 晓，高克祥，印敬明，等.螺旋毛壳ND35β－1，3－葡聚糖酶的诱导、性质及其抑菌作用［J］.植物病理学报，2005，35(6):493－503.

［3］段会轲.水溶性酵母β－1，3－葡聚糖的酶法制备及其抗肿瘤活性研究［D］.武汉:华中农业大学，2007.

［4］陈春锋，杨晓彤.药用真菌β－(1→3)－D－葡聚糖构效关系及检测方法研究进展［J］.微生物学通报，2006，33(5):150－151.

［5］韩 晶，李宝坤，李开雄，等.β－葡聚糖酶的特性与应用研究［J］.中国酿造，2008(17):4－7.

［6］杨贵明，蒋爱华，薛秋生.用DNS光度法测定还原糖的条件研究［J］.安徽农业科学，2006，34(14):3246.

［7］熊 涛，徐立荣，曾哲灵.β－葡聚糖酶的研究进展［J］.四川食品与发酵，2006(6):1－4.

［8］王云川，殷蔚申.β－1，3－葡聚糖酶的研究和应用［J］.微生物学通报，1998，25(2):74－76.

［9］邹东恢，江 洁.β－葡聚糖酶的开发与应用研究［J］.农产品加工学报，2005，(8):7－9.

［10］OFFICER D I.Effect of multi－ enzyme supplements on the growth performance of piglets during the pre and postweaning periods［J］.Animal Feed Sci.Technol.，1995，55:55－65.

［11］邓 旭，程志敬，卢英华.生物合成法生产β－葡聚糖酶［J］.生物技术，2006，16(6):92.

［12］于 敬，周 晶.生物酶解技术在中药提取中的应用［J］.现代药物与临床，2010，25(5):340－343.

［13］张道义，贾志宏，付明哲，等.中药活性成分及药理作用研究新方法［J］.动物医学进展，2008，29(12):89－93.

［14］黄国宏，李科德，曾庆孝.酵母β－1，3－葡聚糖研究进展［J］.酿酒科技，2006(12):1000－103.

［15］刘长江，金 桥，宋 月，等.产β－1，3－葡聚糖酶海洋细菌的筛选及其酶学性质研究［J］.水产科学，2010，29(12):703－706.