食用菌提取液中氨基酸与金属离子锌配合工艺

陈 平，殷辉莉

(哈尔滨商业大学食品工程学院，哈尔滨 150076)

食用菌有较高的食用价值，例如香菇中含有各种人体必需的氨基酸.锌是动物体内许多酶的组成成分，参与了氨基酸、核酸、脂肪、碳水化合物及微量元素等营养元素的代谢［1］.而复合氨基酸配合盐具有抵抗干扰，很容易被动物体消化吸收.在补充锌的同时又补充了动物体所需的氨基酸.

本文采用食用菌香菇等为原料经酸法提取得复合氨基酸与乙酸锌(Zn(CH3OO)2)在适当条件下进行配合反应制备复合氨基－锌(II)的配合，并对其最适反应条件及结构进行初步的研究.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

复合氨基酸，自制;蒸馏水，实验室自制;乙酸锌、盐酸、氢氧化钠、硫代硫酸钠、冰醋酸、乙酸钠、二硫腙、四氯化碳和百里香酚兰均为分析纯，天津市嘉兴化工有限公司.

1.2 仪器与设备

FA2004N电子天平，上海精密科学仪器有限公司;85－2控温磁力搅拌器，江苏金坛医疗仪器厂;LD4－2A低速离心机，上海科贺圣华科技有限公司;TU1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公责任公司;722E分光光度计，上海光谱仪器有限公司;RE52－98旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;GZX－DH－30×35电热恒温箱，上海跃进医疗器械厂，Spectrum one红外分光光度计，PerkinElmer公司.

1.3 复合氨基酸的制备

经过研磨的食用菌粉取5 g用5 mol/L盐酸水解，料液比1∶30加热回流5 h，水解液趁热过滤，滤液经调酸度pH值为1.5后加活性碳，在80℃属于震荡30min脱色完全，并使用氨基酸交换树脂对提取液中复合氨基酸进行纯化，然后将纯化液加NaOH调酸度pH值为3.0，再加入丙酮，产生乳白色沉淀，经过离心烘干，制得混合氨基酸［2］.

1.4 锌标准曲线的的绘制

采用GB/T 5009.14—1996食品中锌的测定方法中的二硫腙比色法.

锌标准溶液:准确称取0.1000 g锌，加10mL盐酸(2 mol/L)，溶解后移入1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度.此溶液每毫升相当于100.0μg锌.

锌标准使用液:吸取1.0mL锌标准溶液，置于100mL容量瓶中，加1mL盐酸(2 mol/L)，定容.此溶液每毫升相当于1.0μg锌.

吸取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL 锌标准使用液，分别置于125mL分液漏斗中，各加盐酸(0.02 moL/L)至20mL.在各分液漏斗中加10mL乙酸－乙酸盐缓冲液、1mL硫代硫酸钠溶液(250 g/L)，摇匀，再各加入10.0mL二硫腙使用液，剧烈振摇3min.静置分层后，将四氯化碳层滤入1 cm比色杯中，以四氯化碳调节零点，于波长520 nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标，锌质量比(μg)为横坐标，绘制标准曲线.

1.5 配合物的合成工艺

取一定质量比的复合氨基酸和乙酸锌混合溶于250mL水中，控制溶液温的反应度，调节pH值，反应一定时间后［3］，减压抽滤，洗涤沉淀3次.将所得沉淀干燥，得到微黄色产品.

1.5.1 配合物的最佳合成工艺的确定

在复合反应过程中，反应液pH值、温度、反应时间，这些因素都会影响着整个反应的进程，因而采用单因素分析的方法，固定其中两个变量的值，改变另一个变量的值，从而分析该变量的变化对复合反应的影响.最后用正交实验确定最佳的配合条件［4－5］.采用 GB/T 5009.14—1996 食品中锌的测定方法中的二硫腙比色分光光度法分析.据吸光度的变化趋势，确定出最适反应条件.取反应后离心分离得到的上清液做吸光度测定，来确定残余的锌离子浓度.

1.5.2 配合率的计算

准确移取复合氨基酸－锌(II)配合物浓缩液10mL于100mL容量瓶中，定容，摇匀.用EDTA络合滴定法测定微量元素的总量.

另移取复合氨基酸－锌(II)配合物浓缩液10mL于100mL烧杯中，继续加热浓缩至近干.加入50mL无水乙醇，水浴温热充分搅拌后，离心分离，将沉淀用水溶解，转移至100mL容量瓶中，定容，摇匀.用EDTA络合滴定法测定螯合态微量元素的质量比.

准确移取25mL试液于250mL锥形瓶中，加入50mL水，滴加2～3滴 PAN指示剂，用0.02 mol/L EDTA标准溶液滴定，溶液颜色由紫红变为淡黄色即为滴定终点［6］.

1.5.3 配合物的配合比的确定

采用等摩尔连续变化法［7］，配制一系列浓度的金属锌离子溶液和复合氨基酸溶液，使锌离子和复合氨基酸的浓度总和为一定值，而连续改变金属离子和复合氨基酸的浓度之比值，测定各测试溶液的配合率，以吸光度A－f(复合氨基酸的物质的量与锌离子的物质的量之比)作图，由图可确定配合物的配合比.

1.5.4 配合产物的确定

对产物进行红外分析，确定其为目标产物［8］.

2 结果与分析

2.1 香菇中复合氨基酸的组分

分析如表1.

表1 香菇中非必需氨基酸的质量比

表2 香菇必需氨基酸的质量比

2.2 锌标准曲线的绘制

锌标准曲线如图1所示，锌质量比在0～7μg范围内线性关系良好，相关系数r=0.9974，回归方程 y=0.0938x+0.0406.

图1 锌的标准曲线

2.3 配合物的最佳合成工艺的确定

2.3.1 反应最佳温度的确定

调节溶液pH值为8.0，反应40min，改变反应的温度，取反应后离心分离得到的上清液做吸光度测定，结果如图2所示.

图2 温度对配合反应的影响

结果表明:当温度小于等于60℃时，吸光度随温度的升高而逐渐减小.说明在60℃前配合反应不完全，大于60℃时吸光度几乎不变，配合反应完全.

2.3.2 反应最佳时间的确定

调节溶液pH值为8.0，反应温度60℃，改变反应的时间，取反应后离心分离得到的上清液做吸光度测定，结果如图3所示.

图3 时间对配合反应的影响

结果表明:当时间小于等于40min时，吸光度随温度的升高而逐渐减小.说明在40min前配合反应不完全，大于40min时吸光度变化不大，配合反应完全.再延长反应时间没有任何意义.

2.3.3 反应最佳pH值的确定

控制反应温度60℃，反应的时间40min，调节反应的pH值，取反应后离心分离得到的上清液做吸光度测定，结果如图4所示.

图4 pH值对配合反应的影响

结果表明:pH值随着混合溶液的碱性增强，吸光度在逐渐的减小.当pH值为8.0时最小，当pH值大于8.0时吸光度上升，有副反应发生.说明螯合物部分开始解离.

2.3.4 配合物的最佳合成工艺的确定

在单因素实验的基础上，以取反应后离心分离得到的上清液测定的吸光度值为指标，以反应pH值、反应时间、反应温度为考察的因素.采用 L9(34)表进行正交实验，优化合成最佳条件.对实验结果进行方差分析，见表3、4、5.

表3 因素与水平

在单因素试验的基础上，确定以配合反应pH值、配合反应温度、配合反应时间3个因素，选用L9(34)正交表进行正交试验，结果如表4所示.由表4可知，复合氨基酸－锌(II)的最佳合成工艺为:配合反应pH值为8.0，配合反应时间40min，配合反应温度为65℃.各种因素对配合反应效果影响的主次顺序依次为:反应pH值＞反应温度＞反应时间.通过方差分析(表5)可知，反应pH值因素对复合氨基酸－锌(II)影响均达显著水平(P＜0.05)，反应时间不显著.

表4 正交试验表

表5 正交试验方差分析表

2.4 验证实验

按正交实验确定的最佳条件，即配合反应温度65℃，反应时间40min，反应pH值为8.0，进行配合反应，测得取反应后离心分离得到的上清液的吸光度值为0.008，比正交实验结果中的较优组0.009小.所以认为此正交实验得出的优水平是可靠的.

2.5 配合物配合比的测定

等摩尔连续变化法实验结果如图5所示.

图5 复合氨基酸－锌(Ⅱ)配合比的确定

2.6 配合产物的确定

用KBr压片法测定复合氨基酸－锌(Ⅱ)在400 ～4000 cm－1的红外光谱.谱图如图6、7.

复合氨基酸与锌离子形成配合物后，它的一些主要吸收峰发生了明显位移，证实二价锌离子与复合氨基酸发生了配位作用.在复合氨基酸的红外光谱图中3067.23 cm－1的峰为－NH2和－COOH中的－OH合起来的长宽峰［8］.复合氨基酸在2747 cm－1、2659 cm－1、2485 cm－1特征峰是醛类的 CH伸缩峰，说明复合氨基酸中有糖类杂质的存在，但是在配合物的IR谱图中完全消失，说明杂质没有参与锌的配合反应.复合氨基酸图谱中1644.02 cm－1由碳基(－C=O)的伸缩振动引起的特征吸峰.当复合氨基酸与锌配合后，配合物的红外光谱显示，氨基的特征吸收峰明显存在，但移至3411.92 cm－1处.同时，碳基的特征吸收移至1572.66cm－1处.这是由于复合氨基酸的氨基和羧基氧参与配位形成配合物的结果.

2.6 配合率的测定结果

配合率(%)=(配合态微量元素的质量比/微量元素的总量)×100=(CV1/CV0)×100=(V1/V0)×100

其中:C为标准EDTA溶液的浓度，mol/L;V1为滴定配合态微量元素所消耗的EDTA溶液体积，mL.V0为滴定微量元素的总量所消耗的EDTA溶液体积，mL.

复合氨基酸－锌(Ⅱ)的配合率测得结果为98.93%

3 结语

本实验研究了复合氨基酸与锌离子配合的最佳反应条件，得到最佳反应条件为:pH值为8.0，反应温度60℃，反应时间40min.通过等摩尔连续变化法并通过IR对合成产物进行了初步的表征，测得产物配合比为2∶1.配合率可达98.93%.

［1］龚 毅，胡晓波.锌氨基酸螯合物的抑菌活性研究［J］.食品科学，2009，84－87.

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