海南省汉族和黎族妇女亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶基因多态性分布研究

劳海红 贺宪民

1.海南省妇幼保健院(海口，570206);2.海南主健细胞分子遗传医学检验中心

5，10－亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)是叶酸代谢通路中的关键酶。MTHFR C677T与神经管缺陷(NTDs)的关联关系研究在国内和国外开展很普遍，TT基因型是NTDs发生的遗传危险因素;MTHFR A1298C、MTRR A66G也都在国内和国外的人群中被研究证明与NTDs的发生相关。神经管缺陷是一类发生率高、后果严重的出生缺陷，是遗传因素和环境因素共同作用的结果，为多基因遗传疾病［1］。本研究的目的在于比较海南省汉族和黎族妇女人群MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G多态性分布情况，获得群体遗传学特征，了解叶酸代谢相关基因在不同人群的分布，为不同人群预防出生缺陷制定针对性的干预措施提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

依据知情同意，选择在海南省各保健院进行孕前或孕期检查的女性作为研究对象，其中，汉族10 533人，黎族904人。

1.2 仪器及试剂

Centrifuge离心机(德国艾本德公司);7900HT实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司);3730测序仪、9700 PCR扩增仪、荧光定量缓冲液、荧光定量检测探针、BigDye® Terminator v3.1测序试剂盒、测序缓冲液(ABI公司)和POP－7TM3730/3730xl DNA测序胶(美国生命技术公司)。检测中对3个位点分别进行荧光定量PCR反应，反应所用Taqman－MGB探针信息见表1。

表1 Taqman－MGB探针所在位置

1.3 研究方法

1.3.1 样本DNA采集 采集受检者的口腔黏膜上皮细胞，利用柱式抽提试剂盒抽提样本DNA。

1.3.2 基因检测 MTHFR 基因 C677T、A1298C和MTRR基因A66G位点的SNP分型采用Taqman－MGB技术。

1.3.3 荧光定量PCR反应条件 每个反应体系为总体积 10μl，包含浓度为 20ng/μl的 DNA 模板1μl，2 × Taqman Universal MasterMix 5μl，20 × Taqman－MGB 探针0.5μl，去离子水3.5μl。反应条件为95℃ 10min，随后进行20个循环的扩增(92℃15s，60℃ 1min)，再进行30个循环的扩增(89℃15s，60℃ 90s)。反应结束后在ABI 7900型荧光定量PCR仪上读取样品孔中的终点荧光，利用分析软件确定各个样本的基因分型结果。

1.4 数据统计分析

对获得的数据用Excel汇总分析，不同人群间基因型及等位基因频率用χ2检验分析。

2 结果

2.1 研究对象基因型频数分布比较(表2)

表2 两民族妇女MTHFR、MTRR基因型频数和频率分布［例(%)］

2.2 研究对象的等位基因频率比较

汉族妇女MTHFR C677T突变等位基因T 频率高于黎族妇女，而黎族妇女MTHFR A1298C突变等位基因C、MTRR A66G突变等位基因G则高于汉族妇女(P ＜0.01)。见表3。

表3 两民族妇女MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G等位基因频率和频率分布［例(%)］

3 讨论

一些研究报道，不同种族人群MTHFR基因热敏性多态性基因型分布存在差异，如国内裴丽君等［2］报道的中国汉蒙两族存在民族差异，但未见有关黎族的研究报道。贺宪民等［3］报道:MTHFR C677T位点纯合突变基因型TT的频率北方显著高于南方(P＜0.01);南方的四川省和海南省间的差异有统计学意义(P=0.02)。MTHFR A1298C基因北方纯合突变基因型CC的频率显著低于南方(P＜0.01)，南方的四川省和海南省间无差异。MTRR A66G基因型的构成在北方和南方间无统计学差异;纯合突变基因型GG的构成在北方和南方间无统计学差异。

本研究比较了海南省汉族和黎族妇女的MTHFR C677T位点纯合突变基因 TT、MTHFR A1298C纯合突变基因CC和MTRR A66G纯合突变基因GG的频率后发现，海南汉族妇女MTHFR C677T纯合突变基因TT频率明显高于海南黎族妇女，而海南黎族妇女MTHFR A1298C纯合突变基因CC和MTRR A66G纯合突变基因型GG频率显著高于海南汉族妇女。海南汉族妇女MTHFR C677T突变等位基因T频率显著高于海南黎族妇女，而海南黎族妇女MTHFR A1298C突变等位基因C、MTRR A66G突变等位基因G则显著高于海南汉族妇女。

目前认为，MTHFR和MTRR是叶酸代谢过程的关键酶，如果这些酶活性或浓度下降均可使同型半胱氨酸的甲基化发生障碍，导致同型半胱氨酸水平升高，是心血管系统疾病和子代发生NTDs的重要危险因素。国外研究表明，携带MTHFR突变基因型的个体发生冠心病的危险性增加，父母携带突变基因型增加子代 NTDs发生的危险性［4，5］。国内李智文等［6］报道，携带MTHFR突变基因型的个体发生冠心病以及子代发生NTDs的危险性显著上升;特别是携带纯合突变基因型的个体，其冠心病发生的危险性是野生型的2.35倍;父母携带纯合突变基因型，子代NTDs的危险性增加3.13倍。

本研究显示，海南省汉族和黎族妇女MTHFR和MTRR基因多态性分布存在显著差异。这种差异要求在制定相关人群健康干预方案时不能使用统一模式、执行统一标准，而应是因人而异，制定有针对性的干预措施。

1 朱军，王和.增补小剂量叶酸预防神经管缺陷［M］.成都:成都时代出版社，2008:1－4.

2 裴丽君，朱慧萍，沈婉英，等.中国汉蒙两族人群MTHFR基因热敏感性多态性分布的比较［J］.遗传，2000，22(6):371.

3 贺宪民，张群，杨琦，等.亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶基因多态性研究［J］.中国计划生育学杂志，2010，18(1):15－16.

4 Pan XR，Li GW，Hu YH，et al.Effects of diet and exercise in preventing NIDDM in people with impaired glucose tolerance:the Da Qing IGT and Diabetes Study ［J］.Diabetes Care，1997，20(4):537－544.

5 UK Prospective Diabetes Study Group.Effect of intensive bloodglucose control with metformin on complications in overweight patients with type 2 diabetes［J］.Lancet，1998，352(9139):854－856.

6 李智文，张晖，王丽娜.中国人5，10亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与冠心病、神经管畸形易感性关系的Meta分析［J］.中国慢性病预防与控制，2004，12(4):165.