HPLC-ELSD测定益气养血口服液中黄芪甲苷的含量

武子敬，孙仁爽，沈笑媛，冉 靓

（1．通化师范学院，吉林通化 134002；2．上海苏豪逸明制药有限公司，上海 200333；3．贵阳学院，贵州贵阳 550005）

益气养血口服液是中国药典收录的中成药，方中含有人参、党参、黄芪、陈皮、当归、白术、五味子等共13味药。具有益气养血的功效，用于气血不足所致的气短心悸、面色不华、体虚乏力[1]。其中黄芪是主药之一，黄芪的主要成分有黄芪多糖（APS）、单糖、黄酮、生物碱（胆碱、甜菜碱）、叶酸、多种氨基酸、葡萄糖醛酸、苦味素及硒、硅等多种微量元素[2]，其中主要活性成分为黄芪多糖和黄芪甲苷[3]。

依据药典中原质量标准，测定黄芪甲苷的含量采用薄层扫描法。薄层扫描法是把被测样品经薄层板分离后，用薄层扫描仪在样品特定吸收波长处扫描，利用仪器测量透过斑点或被斑点反射的光束强度的变化来进行定量分析[4]。中药复方制剂中黄芪甲苷含量的测定并不适合采用薄层扫描法[5]，因为存在检测周期长、重现性差、不稳定的缺点。该试验采用高效液相色谱–蒸发光散射检测法[6]（Highperformance liquid chromatography–evaporative light-scattering detection，HPLC–ELSD）检测益气养血口服液中黄芪甲苷的含量，操作简便、准确、稳定、重现性好，为益气养血口服液的质量控制提供了新方法。

1 仪器与试药

美国Agilentl2000高效液相色谱仪；蒸发光散射检测器；KQ-500型超声波清洗机。

黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号110781-200613）；纯净水；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。供试品：益气养血口服液（批号 20090806）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：AgilentlTc-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈–水（35︰65）；检测器：蒸发光散射器检测器；柱温35℃，漂移管温度60℃。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取黄芪甲苷对照品4.06 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并加至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取益气养血口服液样品15 mL，置分液漏斗中，加水饱和正丁醇溶液25 mL，振摇提取3次，合并正丁醇液，再用氨试液充分洗涤2次，每次25 mL。弃去氨液，再用水洗涤2次，每次20 mL，弃去水液，取正丁醇层，置水浴锅上蒸干，残渣加甲醇溶解后转移到5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.4 阴性对照品的制备

取缺少黄芪的处方药材，按制备工艺制成阴性制剂，依“2.3”项的方法制成供试液，作为阴性对照品溶液。

2.5 系统适用性试验

分别取黄芪甲苷对照品溶液、益气养血口服液供试品溶液和缺黄芪的阴性对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图，见图1。

图1 高效液相色谱图

2.6 线性关系考察

分别精密吸取“2.2”项所述对照品溶液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 置 1 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。取以上溶液各10μL分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图。以峰面积的常用对数为纵坐标，以对照品浓度的常用对数为横坐标作线性回归，得回归方程为Y=1.522X+4.97，R=0.999 7，线性范围 4.06～8.12 μg。

2.7 精密度试验

取同一供试品溶液，在选定的色谱条件下，依法操作测定，重复进样5次，每次进样10μL。以峰面积计算相对标准偏差（Relative standard deviation[7]，RSD）为1.17%。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在 0、2、4、8、12、24 h后，依法操作测定。以峰面积计算RSD为1.11%。

2.9 重现性试验

取相同批号样品6份，制备供试品溶液，依法操作测定。将测得数据代入“2.6”项的回归方程中，计算黄芪甲苷平均质量分数0.126 2 mg/mL，其RSD为1.18%。

2.1 0 回收率试验

采用加样加收法，精密称取同一批号样品适量，分别加入黄芪甲苷对照品溶液0.4 mL，照“2.3”项下方法制成供试品溶液，分别进样10μL，按上述色谱条件测定黄芪甲苷的含量，计算加样加收率。结果表明，该方法的平均回收率为96.44%，RSD为1.24%（n=6）。

3 结果分析

对比供试品溶液和对照品溶液的色谱图，可见黄芪甲苷的峰峰形对称；对比对照品溶液和阴性对照品溶液的色谱图，可见黄芪甲苷的峰与益气养血口服液方中其他成分的峰区分明显。所以，采用HPLC–ELSD测定益气养血口服液中黄芪甲苷的含量，其结果不会受到方中其他成分的干扰。

由加样加收法测定回收率试验，回收率大于95%，RSD较小，说明该试验可行。

线性回归分析结果表明，色谱图中黄芪甲苷峰面积与其含量的线性关系良好。

分析精密度试验、稳定性试验和重现性试验结果，可以看出RSD都比较小，说明该方法在精密度、稳定性和重现性方面皆有理想表现。

4 讨论

目前在2005版《中国药典》收载的含黄芪的中成药中，只有部分采用HPLC–ELSD法来测定黄芪甲苷含量。益气养血口服液中黄芪为主药，复方成分多，药典中采用薄层色谱法对其黄芪甲苷含量进行测定，操作步骤繁琐费时[8]，测定不稳定，重现性不理想。本试验首次建立了用HPLC–ELSD法测定该口服液中黄芪甲苷的含量，经过对线性范围、精密度、稳定性、重现性等进行方法学考察，证明该方法操作简便，准确可行，选用该文方法进行试验，可以达到生产过程准确控制的要求。

[1]国家药典委员会．中国药典[S]．北京:化学工业出版社,2005：574．

[2]王俊辉,孙志良．黄芪的有效成分及在畜牧生产中的应用[J]．饲料研究,2006(12):19－21．

[3]朱虹云,徐文峥,刘帅英．HPLC–ELSD法测定补血颗粒中黄芪甲苷[J]．中草药,2009,40(8):1247－1249．

[4]罗由萍,邓鹏飞．薄层色谱及其在药用植物研究中的应用[J]．安徽农业科学,2011,39(6):3309－3312．

[5]陈玉杰,金红星,李萍,等．基于HPLC–ELSD法的中药复方制剂中黄芪甲苷含量测定[J]．安徽农业科学,2009,37(35):17304－17305．

[6]曾庆华,张莉莉,孙小凡,等．HPLC–ELSD法测定芒果中的果糖、葡萄糖和蔗糖[J]．安徽农业科学,2010,38(18):9781－9783．

[7]Dodge Y．The Oxford Dictionary of Statistical Terms[M]．Oxford：Oxford University Press,2003．

[8]张玉东,徐士云．益气养血口服液中黄芪的薄层色谱鉴别法探讨[J]．中成药,2007,29(10):1560－1561．