眼针对局灶脑缺血再灌注大鼠脑组织及血液肿瘤坏死因子含量的影响

王鹏琴,周鸿飞,王健,李敬林



眼针对局灶脑缺血再灌注大鼠脑组织及血液肿瘤坏死因子含量的影响

王鹏琴,周鸿飞,王健,李敬林

(辽宁中医药大学附属医院神经内科,沈阳 110032)

探讨眼针疗法治疗缺血性脑血管病的可能机制。采用随机分组将大鼠分为假手术组、模型组与眼针组,改良的线栓方法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型;取上焦区、下焦区、肝区、肾区为施加因素;采用ELISA法检测大鼠脑组织及血液TNF-a含量。眼针组与模型组脑组织及血液TNF-a含量比较,差异有统计学意义(＜0.01)。眼针可降低缺血半暗区皮层脑组织及血液中TNF-a含量。这可能是眼针治疗缺血脑血管病机制之一。

针刺;眼针;脑缺血;肿瘤坏死因子;大鼠

目前脑血管病已成为危害我国中老年人身体健康和生命的主要疾病,其中缺血性脑血管病的发病率占脑血管病75%～80%。肿瘤坏死因子-a(TNF-a),既可以作为炎性细胞因子参加缺血性脑损伤的炎症反应,也可以作为神经细胞凋亡诱导因子参与神经细胞凋亡过程。眼针疗法治疗缺血性脑血管病疗效肯定。本研究从眼针对脑组织及血液中TNF-a的影响探讨其作用机理。

1 材料与方法

1.1 动物分组

选择健康雄性SD大鼠90只,由中国医科大学实验动物中心提供。体重(260±20)g,随机分为假手术组、眼针组与造模组,每组再分为3 h、24 h、72 h时间点三个亚组。

1.2 材料与试剂

试剂盒组成为96孔微孔板1块,已包被抗大鼠TNF-a单抗,样品稀释液1瓶,第一抗体工作液1瓶,酶标抗体工作液1瓶,底物稀释液1瓶,终止液1瓶,洗涤液(20×)1瓶,标准品(冻干粉,4000 pg/mL)两管,OPD片3片,坐标纸1张。

1.3 模型制作方法

1.3.1 模型制作栓线的处理

取3.0号钓鱼用尼龙丝线剪成长45 mm栓线,将头端火焰烧成光滑球面,直径为0.25～0.28 mm,距球面30 mm处用修正液做标记,乙醇消毒后置生理盐水中备用。

1.3.2 模型制作

参照Longa[1]改良的线栓方法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,术前禁食12 h,不禁水,10%水合氯醛 (330 mg/kg)腹腔麻醉,消毒颈部皮肤,沿颈中线偏右做一长度约1 cm切口,仔细分离暴露出右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。结扎颈总动脉及颈外动脉根部,在右侧颈总动脉分叉处以眼科剪剪一“V”形小口,将尼龙线从小口缓慢插入,经颈总动脉分叉处进入右侧颈内动脉入颅,继续轻柔推进,当感到有一定阻力时即停止推送,此时栓线进入深度 1.8～2.0 cm,栓线头端正好位于大脑中动脉起始部位,阻断血流。如栓线进入深度1.0 cm就感阻力,可缓慢退出,调整进线方向靠近颈内动脉侧再缓慢进入。结扎近端备线,防止栓线松动。可见大鼠右眼虹膜颜色变浅,出现右侧Homer’s征。术中及术后保持室温25℃左右,60 W的白炽灯照射动物以维持其肛温在(37.5±0.3)℃。栓塞2 h后,再次麻醉,头位固定,缓慢轻柔拔出1.0 cm尼龙线进行再灌注。将造模成功的大鼠经神经功能缺损评分,均衡分到模型组与眼针组。假手术组插线深度1.0 cm,其他同模型组。

1.3.3 动物模型的评价

参照Longa[1]5分制评分标准,0分为无症状;1分为不能完全伸展对侧前爪;2分为向对侧转圈;3分为向对侧倾倒;4分为不能自发行走,意识丧失。1～3分纳入实验。假手术组在清醒及随后的时间未见明显神经功能缺损症状和体征,术后动物进食及活动恢复良好。

1.4 实验方法

大鼠眼穴定位方法参照彭静山教授著《眼针疗法》[2],记载人体的眼穴划分方法。取上焦区、下焦区、肝区、肾区。用0.35 mm×25 mm毫针在相应眼穴区距眶内缘2 mm处,平刺,由该区始点向该区终点方向刺入0.3 cm,行捻转手法,留针30 min,15 min时行针一次,时间1 min。

针刺时机为再灌注即刻对动物神经功能缺损评分,眼针组在缺血再灌注即刻及每隔12 h、处死前30 min进行眼针治疗。

1.5 标本制作

将大鼠先以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(330 mg /kg)后,腹主动脉取血2 mL,4℃,3000×离心。取上清待测。取血后再断头取脑。用75%乙醇擦湿鼠头部皮毛,从颈部断头,剥去头皮,用剪刀于颅骨上剪一小口,用血管钳仔细钳撬去颅骨充分暴露脑组织,用手术刀片切取缺血侧顶叶大脑皮质约100 mg(冠状面距额极7～11 mm,扇形分出缺血半暗带一大脑纵裂到大脑外侧沟皮层上1/3),迅速匀浆,制成10%组织匀浆液。

1.6 准备试剂与收集标本

1.6.1 洗涤液

用重蒸水1:20稀释;实验标本分别为血液和10%脑组织匀浆液;底物工作液配制使用前将OPD片放入底物稀释液中溶解,每片加液5 mL;标准液配制使用前每管中加入蒸馏水200mL溶解后即用。

1.6.2 操作方法

本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测大鼠脑组织及血液TNF-a含量。建立标准曲线,设标准孔8孔,每孔中加入样品稀释液100mL,混匀后用加样器吸出100mL,移至第2孔。如此反复对倍稀释至第7孔,最后,从第7孔中吸出100mL弃去,使之体积均为100mL。第8孔为空白对照。加样,待测品孔每孔也各加待测样品100mL。将反应板充分混匀后置37℃120 min。

洗板,用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次,滤纸上印干。每孔中加入第一抗体液50mL。将反应板置37℃60 min。

洗板(同前)。每孔加酶标抗体工作液100mL。将反应板置37℃60 min。

洗板(同前)。将每孔加入底物工作液100mL,置37℃暗处反应5～10 min。在492 nm处测吸光值。

1.6.3 结果计算与判断

2 结果

2.1 各组半暗区皮层脑组织TNF-a含量比较

表1 各组半暗区皮层脑组织TNF-a含量比较(ABC-ELISA法) (±s,pg/mL/g)

注:与假手术组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.05,3)＜0.01

缺血半暗带区皮层脑组织中TNF-a含量,各时间点模型组、眼针组与假手术组比较含量有所升高,经统计学处理差异有统计学意义(＜0.01)。眼针组与模型组比较,3 h时间点经比较差异有统计学意义(＜0.05);24 h时间点有非常显著性差异(＜0.01),72 h有显著性差异(＜0.05)。模型组3 h时间点,24 h时间点,72 h时间点含量比较,3 h时间点开始增高,24 h时间点最高,72 h有所下降。详见表1。

2.2 各组脑缺血再灌注血液TNF-a含量比较

表2 各组脑缺血再灌注血液TNF-a含量比较(ABC-ELISA法) (±s,pg/mL)

注:与假手术组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.05,3)＜0.01

血液中TNF-a含量与脑组织中的含量趋势基本相同,眼针组与模型组比较, 3 h时间点经统计学处理(＜0.05),有显著性差异;24 h时间点有非常显著性差异(＜0.01);72 h有显著性差异(＜0.05)。详见表2。

3 讨论

近年来的研究表明,脑缺血再灌注损伤的机制之一,即过度的炎症反应,TNF-a是主要的致炎因子[3,4]。脑缺血再灌注后,TNF-a在脑缺血再灌注后表达增加[5]。TNF-a和其他相关因子的表达在缺血再灌注后引起的炎症反应、细胞凋亡等组织损伤中起着重要的作用。TNF-a的释放可激活多形核白细胞(PMN),增加白细胞-内皮细胞粘附分子的表达,促进白细胞粘附于毛细血管或小血管壁,逐渐渗透至脑组织。活化的PMN可释放多种炎症介质、氧自由基,在脑缺血再灌注后的组织损伤中起重要作用。再者,TNF-a尚可激活脑内的巨噬细胞、内皮细胞及小胶质细胞产生炎性代谢产物[6-8]。保持炎性反应,进一步促进活化细胞进入缺血区及周边部位,产生再次或长期损伤,并影响半暗带的恢复。另一方面,TNF-a还可促进IL-1、IL-6及粒细胞-单核细胞集落因子的释放,协同炎性作用。TNF的受体是TNFRI,TNFRI与TNFRI相关死亡区蛋白(TNFR1- associated protein with death domain,TRADD)形成同源性联结,而TRADD再通过其死亡区与FADD的死亡区结合,进而形成死亡诱导信号复合体,激活caspase-8,启动caspases级联反应,最终激活caspase-3,导致细胞凋亡[9]。

眼针疗法是彭静山教授首创的一种微针疗法。理论依据为眼与脑、脏腑、经络的联系的论述,定穴方法根据眼部八廓配八卦、脏腑的关系确立了眼周八区十三穴。根据眼针的取穴原则,针对中风的疾病基础是肝肾阴虚,取肝区、肾区滋补肝肾,上肢属上焦,下肢属下焦,因此取上焦区、下焦区通经活络,疏通上下肢经脉气血,使肢体经络气血通畅,经脉得养,半身不遂得以恢复。本研究从眼针对缺血再灌注后与炎症和凋亡相关的肿瘤坏死因子(TNF-a)含量变化,探讨眼针治疗中风的可能机理。

我们的实验结果显示,模型组缺血半暗区皮层脑组织中TNF-a含量,与假手术组比较各时间点均升高,经统计学处理差异非常显著。说明缺血再灌注损伤时缺血半暗区皮层脑组织中TNF-a含量升高。眼针组与模型组比较,3 h时间点差异不显著;24 h时间点差异非常显著;72 h差异显著。模型组3 h时间点,24 h时间点,72 h时间点含量比较,3 h时间点开始增高,24 h时间点最高,72 h有所下降。血液中TNF-a含量与脑组织中的含量趋势基本相同。我们推测,脑缺血能快速诱导TNF-a的表达增加,导致缺血脑组织中TNF-a含量升高,其来源可能主要为缺血侧神经元,神经元合成分泌大量TNF-a,进入外周血,进一步导致血清中TNF-a含量亦明显升高。脑缺血后机体处于应激状态,细胞因子网络被快速激活,除神经元外机体其他组织器官可能也合成分泌TNF-a进入外周血,形成累积效应,造成血清中TNF-a升高。

研究结果表明,眼针可降低缺血半暗区皮层脑组织及血液中TNF-a含量,从而抑制缺血再灌注的炎症反应及细胞凋亡,对缺血再灌注的脑损伤起保护作用。

[1] Longa EZ, Weinstein PR, Carison S,. Reversible middle cerebral artery occlusion without carniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1): 84-91.

[2] 彭静山.眼针疗法[M].沈阳:辽宁科技出版社,1991:31.

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Effect of Eye Acupuncture on the Tumor Necrosis Factor Contents of Brain Tissue and Blood in Rats with Focal Cerebral Ischemia and Reperfusion Injury

-,-,,-.

,,110032,

To explore a possible mechanism for eye acupuncture treatment of ischemic cerebrovascular disease.Rats were randomly allocated to sham operation, model and eye acupuncture groups. A rat model of focal cerebral ischemia and reperfusion injury was made by the modified MCA thread-occlusion method. Ear points Shangjiao, Xiajiao, liver and kidney were selected for acupuncture. Rat brain and blood TNF-acontents were measured by ELISA.There was a statistically significant difference between the eye acupuncture and model groups (＜0.01).Eye acupuncture can decrease the TNF-acontents of cerebral ischemic penumbrazone and blood. This may be one of the mechanisms of eye acupuncture treatment for ischemic cerebrovascular disease.

Acupuncture; Eye acupuncture; Cerebral ischemia; Tumor necrosis factor; Rat

R2-03

A

1005-0957(2011)02-0071-03

10.3969/j.issn.1005-0957.2011.02.071

国家重点基础研究发展计划(2007CB512702)

王鹏琴(1962 - ),女,主任医师,博士,硕士生导师

2010-10-20