NGAL在乳腺癌中的表达及意义

王晓鸿 郭永谊 苟新敏

NGAL(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是Lipocalin家族的新成员，于1993年在人中性粒细胞中被发现和分离出来[1]。近年来NGAL与人类肿瘤的关系受到了人们的重视，并在NGAL基因的功能以及NGAL在人体正常和肿瘤组织中的表达特征方面取得了一些有意义的进展。本研究采用免疫组织化学方法检测60例乳腺癌中NGAL蛋白的表达水平，探讨其在乳腺癌中的表达特点及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2003～2010年在中山大学附属第五医院行初次手术且有完整临床病理资料存档的乳腺癌组织石蜡标本60例(术前均未行化疗、放疗或生物治疗)，中位年龄55岁(36～69岁)。病理分级:G114例，G214例，G332例。病理类型:导管癌28例，小叶癌21例，其他类型11例。手术病理分期:Ⅰ期14例，Ⅱ期11例，Ⅲ期22例，Ⅳ期13例。淋巴结转移:有转移24例，无转移36例。正常乳腺组织10例，为同期因其他良性疾病手术切除的卵巢组织，中位年龄43岁(31～58岁)。以已知胰腺癌阳性片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。所有标本均经HE染色证实诊断。

1.2 主要试剂及检测方法 鼠抗人NGAL单克隆抗体购于美国R＆D公司，免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新公司。采用免疫组织化学二步法，石蜡切片逐级脱蜡至水，抗原修复，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min。PBS冲洗，滴加一抗，37℃孵育2 h，PBS洗 3次，5 min/次。滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，5 min/次。DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染，脱水透明，封片，光镜观察。

1.3 结果判定 采用IP(intensity+percentages)评分方法，综合考虑染色强度和阳性细胞数，由两位病理学专家独立阅片，再讨论确定免疫组织化学结果。①染色强度计分，细胞浆无染色:0分;淡黄色:1分;棕黄色:2分;棕褐色:3分。②阳性细胞数计分。细胞浆无染色:0分;染色细胞数＜1%:1分;染色细胞数1% ～10%:2分;染色细胞数10% ～33%:3分;染色细胞数33% ～66%:4分;染色细胞数＞66%:5分。两项之和即为总分。阴性(-):＜2分;阳性(+)～(+++):2～8分;低表达(+):2～4分;中等表达(++):5～6分;高表达(+++):7～8分。

1.4 统计学方法 所有数据采用SPSS 13.0软件包处理。样本率的比较用χ2检验及Fisher确切概率检验，所有的统计分析均分双侧检验。

2 结果

2.1 NGAL在不同性质的乳腺组织中的表达 通过免疫组化检测，可见NGAL的表达定位于上皮细胞胞浆中。正常上皮中，只有2例可见NGAL微弱的表达，并且表达位于细胞浆内靠近细胞膜的局限区域，表达率为10%。60例乳腺癌组织中49例NGAL表达阳性，表达率为81.7%，多为中、高表达(++)～(+++);NGAL的阳性表达率在乳腺癌和正常卵巢组织中比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 NGAL表达与乳腺癌临床病理指标的关系 NGAL蛋白表达与乳腺癌分化程度、病理类型、临床病理分期、淋巴结转移有关。NGAL蛋白在分化程度高(G1～G2)的肿瘤中阳性表达率为67.9%，在分化程度低(G3)的肿瘤中阳性表达率为93.8%，差异有统计学意义(P＜0.05)。NGAL在导管型乳腺癌的阳性表达率为96.4%，在小叶型乳腺癌的表达率为90.5%，在其他类型乳腺癌中的表达率为90.9%，各种类型间无明显差异(P＞0.05)。NGAL蛋白在乳腺癌早期(Ⅰ～Ⅱ)期肿瘤中阳性表达率为68.0%，在晚期(Ⅲ～Ⅳ)肿瘤中阳性表达率为91.4%，差异有统计学意义(P＜0.05)。NGAL蛋白在有淋巴结转移的乳腺癌组织中阳性表达率为91.7%，在无淋巴结转移的乳腺癌组织中阳性表达率为66.7%，差异有统计学意义(P＜0.05)(表1)。

表1 不同临床病理指标的卵巢癌组织中NGAL蛋白的表达

3 讨论

Lipocalin是一个有20多种可溶性蛋白组成的大家族。蛋白质晶体结构分析证实，它们均拥有一个高度保守的由8条反向平行的β折叠形成的桶状亲脂性三级结构，其可结合疏水性的小分子形成复合物，也可与某些细胞膜受体结合[2]，在人体内物质转运，免疫调节等方面发挥着重要作用。NGAL作为Lipocalin家族的一员，其氨基酸序列及DNA内含子和外显子的排列与本家族其他成员有很高的保守性和同源性。这个独特的结构让该家族成员有能力结合一些主要是疏水性的小分子物质而形成复合物，甚至还可以在细胞表面结合特异性受体[3]。在亲脂性小分子物质的转运中发挥作用，更在细胞内环境稳定或免疫调节中扮演重要角色。除中性粒细胞外，正常情况下NGAL蛋白亦可微量表达与腔道表面组织细胞，如呼吸系统的肺泡间巨噬细胞、支气管上皮单个黏液细胞和消化系统的胃壁细胞、小肠部分潘氏细胞、肝胆管细胞、胰小叶内和闰管细胞以及泌尿生殖系统的肾近曲小管细胞、尿道伞部细胞、前列腺上皮细胞等[4]。而在病理状态下，其表达程度明显增强。最初学者认为NGAL可诱导中性粒细胞内颗粒释放，在抗感染中发挥重要作用[5-7]。最近进一步研究通过NGAL在大鼠小鼠中的同源基因研究证实，NGAL蛋白可能为一种新的癌基因，在许多肿瘤中表达上调[8]。Stoesz等于1998年就研究发现，NGAL在乳腺癌组织细胞中表达。在大鼠NGAL的同系物NRL被确定为在HER-2/neu癌蛋白所诱导的乳腺癌发生过程中是唯一表达上调的蛋白，可能是介导大鼠乳腺癌发生的重要分子靶标。Yang等[8]研究发现，在乳腺癌中NGAL/Lipocanlin2的高表达可能在调节肿瘤的浸润与转移中具有重要作用，而通过基因沉默降低NGAL的蛋白水平则能阻止肿瘤细胞的转移。Berger等[9]证实，Lipocanlin2/NGAL基因敲除后，乳腺癌的发生、肿瘤的增殖程度均明显降低，但由此引起的肺转移并未受到影响。另有学者发现，NGAL蛋白的表达水平与乳腺癌肿瘤细胞的S期分数和增殖指数Ki67呈正相关[10]。本研究显示，NGAL蛋白在乳腺癌中显著表达，与正常乳腺组织比较差异具有统计学意义。另外，NGAL在乳腺癌中的表达与肿瘤的分化程度和手术病理类型、分期及淋巴结转移率相关。提示NGAL不仅可以用于肿瘤发生的早期预测，而且在肿瘤的进展、浸润和转移中具有一定作用，但其作用机制目前尚未明确。而Bauer等在乳腺癌中发现，NGAL的表达与癌细胞的淋巴结转移、不良的组织学分级、HER-2/neu过表达以及类固醇激素受体阴性等高度相关[10]。NGAL可以与铁高亲和力结合，介导铁的转运，上调铁易感基因的表达，促进肿瘤细胞的增殖[11-12]。而Shi等用RT-PCR对鼠的乳腺癌细胞株4T1研究发现NGAL不能影响癌细胞的增殖，但能明显促进癌细胞的浸润与转移。而在食管癌的研究中发现，反义封闭NGAL基因表达后，接种裸鼠的癌细胞侵袭能力明显降低[13]。Yang等证明，NGAL能够通过激活ERalpha/Slug信号通路，调节vimentin/fibronectin和E-cadherin的表达及活性，诱导EMT(epithelial tomesenchymal transition)发生，促进乳腺癌细胞侵袭及转移[14]。Fernandez等研究发现NGAL可能通过保护并调节MMP-9的表达及活性而促进肿瘤生长和转移。

乳腺癌是女性肿瘤中的一种多发病，且有高度的家族遗传性，对该病的早期诊断、检测及干预具有非常重要的意义。本研究证实，NGAL可作为乳腺癌发生、进展、浸润及侵袭等发生发展过程中一个重要的检测指标及靶点，是评估肿瘤生物学特性和预后的一个新的参考指标。在筛选高危患者，指导临床制定合理治疗方案等方面具有积极的意义。

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