杜衡挥发油微波辅助提取及气相色谱-质谱联用分析

李 超，王乃馨，郑 义，严茂飞，李姣姣

杜衡挥发油微波辅助提取及气相色谱-质谱联用分析

李 超，王乃馨，郑 义，严茂飞，李姣姣

(徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221008)

在单因素试验基础上，采用Box-Behnken设计对杜衡挥发油微波提取工艺中的液料比、微波功率和微波时间3因素进行研究，分析各因素与得率的关系，得出优化组合，并建立数学模型。结果表明：最佳的工艺条件为液料比(mL/g)8.3:1、微波功率309W、微波时间154s；在此条件下做验证实验，得出杜衡挥发油得率7.96%，与理论值7.90%基本一致，说明回归模型能较好地预测杜衡挥发油提取得率。采用气相色谱-质谱联用技术对杜衡挥发油成分进行分离鉴定，分离出25种成分，共确认了其中19种，采用峰面积归一化法确定了各成分的相对含量。本方法可为杜衡的进一步开发和利用提供参考。

微波辅助提取；杜衡；挥发油；响应曲面法；气相色谱-质谱联用

杜衡(Asarum forbesii Maxim.)为马兜铃科细辛属植物杜衡的根茎及草或全草，又名马辛、南细辛、马蹄香、马蹄细辛，为多年生草本植物，产于江苏、安徽、浙江、江西、河南南部、湖北及四川东部。本品全草入药，具有驱风逐寒、消痰引水、活血平喘、定痛等作用[1]。杜衡主要有效成分为挥发油，其常用提取方法有水蒸气蒸馏法、热回流提取等，都存在提取时间长等缺点。微波辅助提取作为一种优良的提取方法，具有操作简便快捷、提取时间短及提出率高等特点，广泛应用在生物活性物质的提取方面[2-9]。运用微波辅助提取杜衡挥发油的工艺及其成分分析未见报道，本实验在单因素试验基础上运用响应曲面法研究微波辅助提取其挥发油的最佳工艺参数，同时通过气相色谱-质谱联用技术对挥发油成分进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杜衡 安徽亳州市三义堂药业有限责任公司。石油醚(30～60℃)、乙醚、正己烷、乙酸乙酯和无水Na2SO4皆为分析纯。

1.2 仪器与设备

标准检验筛 浙江上虞华美仪器纱筛厂；风选中药粉碎机 山东省青州市精诚机械制造有限公司；FA2104N电子分析天平 上海精密科学仪器有限公司；SENCO R201L旋转蒸发器 上海申生科技有限公司；XMT-152电热恒温干燥箱 上海跃进医疗器械厂；CW-2000型超声-微波协同萃取仪 上海新拓分析仪器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微波提取

杜衡粉碎后过80目筛，精确称取约5g置于100mL特制三角瓶中，加入一定体积的提取剂后，按照试验设计提取一定时间后，在提取液加入无水Na2SO4后过滤，旋转蒸发后称量。根据CW-2000型超声-微波协同萃取仪的特点，提取时将超声波处于关闭状态。

1.3.2 工艺优化设计

1.3.2.1 单因素试验

分别以提取剂种类、液料比、微波功率和微波时间为影响因素考察其对得率的影响。

1.3.2.2 Box-Behnken试验设计

根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验基础上，选取液料比、微波功率和微波时间3个影响因素，采用三因素三水平响应曲面分析方法，因素与水平设计见表1。共15个试验点，其中12个为析因点，3个为中心点。

表1 杜衡挥发油微波辅助提取Box-Behnken试验因素水平表Table 1 Coded variables and their coded levels in response surface analysis

设该模型通过最小二乘法拟合的二次多项方程为：

式中：EY为预测响应值；xi和xj为自变量代码值；β0为常数项，βi为线性系数，βij为交互项系数，βii为二次项系数，ε为随机误差。按照Box-Behnken试验设计的统计学要求，对方程的各项回归系数进行回归拟合。

1.3.3 得率的计算

1.4 气相色谱-质谱联用分析条件

气相色谱条件：色谱柱：HP-5(30m×0.25mm，0.25μm)；进样温度260℃；升温程序为初始温度60℃保持1min，20℃/min升温至100℃，10℃/min升温至250℃，20℃/min升温至290℃、保持5min。载气He，流量为1.0mL/min，溶剂延迟时间：3min；分流比为50:1；进样量为0.2μL。

质谱条件：EI离子源，离子源温度230℃，电子能量70eV，质量扫描范围33～500u，接口温度280℃。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取剂种类的影响

为考察提取剂种类对杜衡挥发油得率的影响，试验设定液料比6:1(mL/g)、微波功率200W和微波时间90s，在不同提取剂条件下对得率进行研究，结果见图1。

图1 提取剂种类对得率的影响Fig.1 Effect of different solvents on oil yield

作为提取杜衡挥发油的理想溶剂应具有以下特性：对挥发油的溶解性好、选择性好，性质稳定、价格低廉、来源广泛。杜衡挥发油的提取属于固-液萃取过程，提取效果主要由原料颗粒度和溶剂的性质决定。从图1可知，4种溶剂中出得率最高的为正己烷7.19%，同时注意到采用正己烷和乙酸乙酯的得率相差不大，但乙酸乙酯的价格却是正己烷的二分之一。因此选择乙酸乙酯作为杜衡挥发油的提取剂。

2.1.2 液料比的影响

为考察液料比对杜衡挥发油得率的影响，选择乙酸乙酯作为提取剂，同时设定微波功率200W和微波时间90s，在不同液料比条件下对得率进行研究，结果见图2。

由图2可知，乙酸乙酯的增加，更有利于杜衡挥发油的溶出，这是因为溶剂和原料间的浓度差越大，其提取效率就越高，目标物质就越容易溶出，然而在液料比增加到8:1之后，杜衡挥发油得率有下降的趋势，这是因为当溶剂过大时，微波的能量对沉滞低层的杜衡颗粒的热效应(相同时间提供的热量被提取剂吸收的比例增加)的强度减弱，影响提取的效果，同时会造成溶剂和能源的浪费，并给后续的浓缩工作带来困难。因此选择液料比为8:1进入后续试验。

图2 料液比对得率的影响Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on oil yield

2.1.3 微波功率的影响

为考察微波功率对杜衡挥发油得率的影响，试验选择乙酸乙酯作为提取剂，同时设定液料比8:1(mL/g)和微波时间90s，在不同微波功率的条件下对得率进行研究，结果见图3。

图3 微波功率对得率的影响Fig.3 Effect of microwave power on oil yield

由图3可知，随着微波功率的增加，物质的加热程度也随之增加，使杜衡挥发油能够容易地被提取出来，即得率增加；在微波功率达到300W之后，杜衡挥发油得率有减少的趋势，这可能是由于高微波功率的热效应导致杜衡挥发油分解或挥发所致[10]。因此选择300W进入后续试验。

2.1.4 微波时间的影响

为考察微波时间对杜衡挥发油得率的影响，试验选择乙酸乙酯作为提取剂，同时设定液料比8:1(mL/g)和微波功率300W，在不同微波功率的条件下对得率进行研究，结果见图4。

由图4可知，在微波时间为150s之前，杜衡挥发油不能充分转移到溶液中，随着微波时间的延长，杜衡挥发油得率增加，在150s时达到峰值，之后，继续延长时间，得率有所下降，这可能是因为随着微波时间的延长，温度急剧升高，导致杜衡挥发油分解或挥发所致[11-12]。因此150s为最佳微波时间。

图4 微波时间对得率的影响Fig.4 Effect of microwave treatment time on oil yield

2.2 Box-Behnken试验

2.2.1 模型的建立及显著性检验

表2 微波辅助提取杜衡挥发油Box-Behnken试验结果Table 2 Box-Behnken experimental design scheme and corresponding experimental results

表3 响应曲面二次回归方程模型方差分析结果Table 3 Analysis of variance of the developed quadratic regression model

利用Design expert V7.0.0统计软件通过逐步回归对表2试验数据进行回归拟合，得到杜衡挥发油得率对以上三个因素的二次多项回归模型为：

对该模型进行方差分析，结果见表3。由表3可见，模型极显著(P＜0.01)，失拟项(P＞0.05)不显著以及R2Adj=0.9179和RSN(信噪比)为12.823≥4，可知回归方程拟合度和可信度均很高，试验误差较小，故可用此模型对微波提取杜衡挥发油的工艺结果进行分析和预测。2.2.2响应曲面分析与优化

根据回归方程的响应曲面图，考察所拟合的响应曲面的形状，分析液料比、微波功率和微波时间对得率的影响。其响应曲面及其等高线如图5所示，3组图直观地反映了各因素对响应值的影响。

图5 各因素交互作用对得率影响的响应面和等高线Fig.5 Response surface and contour plots for the effects of pairwise interactions of three operating parameters on volatile oil yield

等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。比较3组图并结合表3中P值可知：模型的一次项x2(P＜0.05)和x3(P＜0.05)显著、x1(P＞0.05)不显著；交互项x1x2(P＜0.05)显著，其他各交互项都不显著；二次项x12(P＜0.05)显著，其他二次项都极显著，表明各影响因素对杜衡挥发油得率的影响不是简单的线性关系。

为进一步确定最佳提取工艺参数，对所得方程进行逐步回归，删除不显著项，然后求一阶偏导，并令其为0，可得最佳工艺参数为液料比8.3:1(mL/g)、微波功率309W和微波时间154s，此时杜衡挥发油得率为7.90%。

2.2.3 验证实验

为检验Box-Behnken试验设计所得结果的可靠性，采用上述优化出的工艺参数提取3次，实际测得的平均得率为7.96%，与理论预测值相比，其相对误差约为0.76%。因此，基于Box-Behnken试验设计所得的最佳工艺参数准确可靠，具有实用价值。

2.3 杜衡挥发油化学成分的气相色谱-质谱联用分析

图6 微波辅助提取杜衡挥发油的气相色谱-质谱联用分析总离子流图Fig.6 GC-MS total ion current chromatogram of volatile oil extraction from Asarum forbesii Maxim by optimized microwave-assisted method

表4 杜衡挥发油化学成分的分析结果Table 4 Chemical composition of volatile oil from Asarum forbesii Maxim

取最佳提取工艺参数下的杜衡挥发油适量按上述气相色谱-质谱联用分析条件，通过气质联用仪对杜衡挥发油化学成分进行分析，各分离组分利用计算机谱库(NIST 05)进行检索和有关文献进行人工谱图解析，采用色谱峰面积归一化法进行相对定量[13-15]。从杜衡挥发油中共分离出25个峰，确定了其中的19种化合物，所鉴定成分占总挥发油的95.64%，经气相色谱面积归一化法测定了各组分的相对含量，分析鉴定结果见图6和表4。相对含量在1%以上的有9种化合物，占总化合物的89.85%，其中相对含量最高的是甲基丁香酚，占35.76%，其次是橄香素，占22.77%，居第三位的是细辛脂素，占12.78%。在已鉴定出的19种化合物与文献[8-10]报道既有相似的地方也有一定的区别的，原因可能是原料产地不同也有可能是由提取方法不同造成的。

3 结 论

3.1 在单因素试验基础上建立一个以杜衡挥发油提取得率为目标值，以液料比、微波功率和微波时间为因素的数学模型，方差分析表明拟合较好。通过对回归方程优化计算，得到提取的最佳工艺条件为液料比8.3:1 (mL/g)、微波功率309W和微波时间154s。对所建立的数学模型进行验证实验，在最优条件下，得到杜衡挥发油得率为7.96%，与理论值7.90%基本一致。

3.2 从杜衡挥发油中共分离出25个峰，确定其中的19种化合物，所鉴定成分占总挥发油的95.64%，经气相色谱面积归一化法测定各组分的相对百分含量，其中相对含量最高的是甲基丁香酚，占35.76%，其次是橄香素，占22.77%，居第3位的是细辛脂素占12.78%。

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Microwave-assisted Extraction and Gas Chromatography-Mass Spectrometry Analysis of Volatile Oil from Asarum forbesii Maxim

LI Chao，WANG Nai-xin，ZHENG YI，YAN Mao-fei，LI Jiao-jiao
(College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

The optimization of the extraction of volatile oil from Asarum forbesii Maxim with microwave assistance was studied through one-factor-at-a-time instigations followed by mathematical modeling for extraction efficiency as a response to liquid-tosolid ratio, microwave power and treatment time based on the principle of Box-Behnken experimental design and response surface analysis of model. Liquid-to-solid ratio of 8.3:1, microwave power of 309 W and treatment time of 154 s were found optimum for the extraction of volatile oil with ethyl acetate, which was selected out of four common organic solvents based on oil yield. Under these conditions, the experimental value of oil yield was 7.96%, substantially complying with the theoretical value. This indicates good reliability of the developed regression model in predicting oil yield. The volatile oil extracted by the optimized method was subjected to separation and identification on a gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) system. A total of 25 constituents were separated and 19 of them were identified and quantified by area normalization method. This study can provide useful references for the development and exploitation of Asarum forbesii Maxim.

microwave-assisted extraction；Asarum forbesii Maxim；volatile oil；response surface methodology；gas chromatography-mass spectrometry

TS224.4

A

1002-6630(2011)04-0121-05

2010-03-28

徐州工程学院青年项目(XKY2009121)

李超(1978—)，男，讲师，博士，研究方向为天然产物化学。E-mail：chaoge002@163.com