呼和浩特地区牛羊布鲁菌流行株种及生物型鉴定*

赵林立,唐泰山,赵治国,王海艳,敖威华,刘 虹

(1.内蒙古出入境检验检疫局,内蒙古呼和浩特 010020;2.江苏出入境检验检疫局,江苏南京 210001)

呼和浩特地区牛羊布鲁菌流行株种及生物型鉴定*

赵林立1,唐泰山2,赵治国1,王海艳1,敖威华1,刘 虹1

(1.内蒙古出入境检验检疫局,内蒙古呼和浩特 010020;2.江苏出入境检验检疫局,江苏南京 210001)

应用常规细菌学方法,对呼和浩特部分地区疑似布鲁菌病的牛、羊流产胎儿病料进行了布鲁菌分离,共分离到4株布鲁菌。进一步根据细菌形态、培养特性、生化特性以及平板凝集试验等对分离到的细菌进行种型鉴定。结果表明,其中3株为羊种布鲁菌生物3型,1株为牛种布鲁菌生物3型。本研究结果为内蒙古地区布鲁菌病的防控奠定了病原学基础。

分离;鉴定;羊种布鲁菌生物3型;牛种布鲁菌生物3型

布鲁菌病(Brucellosis)是由布鲁菌属(Brucella)的不同种布鲁菌引起人及多种动物共患的细菌性传染病,该病是世界动物卫生组织(Office International des Epizooties,OIE)确定的必须报告的传染病。在家畜中,牛、羊、猪布鲁菌病时有发生[1],给养殖业造成巨大的经济损失。由于该病可经动物传播给人类,故其在公共卫生学上具有重要意义。多年来,我国所采取的以净化为主的综合性防控措施取得了一定效果,但近年来,人畜布鲁菌病疫情在部分地区又有回升势头[2]。

布鲁菌属依据其表型和储存宿主不同分为6个种、19个生物型[3]。调查显示,我国主要流行的布鲁菌有马耳他布鲁菌、流产布鲁菌和猪布鲁菌,虽然不同种具有一定的宿主选择性,但不同动物之间的交叉感染也非常普遍,这给本病的防控带来了较大的困难,因此,确定地区流行菌株的种和生物型,对丰富布鲁菌病流行病学资料,查明感染来源,切断传染途径等均十分重要。本试验对采集于内蒙古呼和浩特地区牛羊养殖场的疑似布鲁菌病的流产病料,进行了病原分离、鉴定及种型确定,为该地区布鲁菌病的有效防控奠定了重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 从呼和浩特地区饲养场采集的5头奶牛流产胎儿、3只绵羊流产胎儿。

1.1.2 仪器设备 生物安全柜为美国Nualre公司产品,生化培养箱为广东医疗器械厂产品,光学显微镜为日本Olympus公司产品。

1.1.3 试剂 布鲁菌琼脂培养基、尿素酶活性试验、糖发酵试验、M R试验、VP试验、明胶液化试验、柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、石蕊牛乳试验等所需试剂及细菌生化鉴定管,均为北京陆桥技术有限责任公司产品;布鲁菌阳性和阴性血清及A、M、R因子血清均由内蒙古地方病研究所馈赠。

1.2 方法

1.2.1 选择性培养基的配制 布氏琼脂培养基:分别称取胰蛋白胨10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉2.0 g、葡萄糖1.0 g、氯化钠5.0 g、亚硫酸氢钠0.1 g,加入1 000 mL蒸馏水,加热溶解后调节pH至7.0,每100 mL培养基中加入放线酮10 mg,万古霉素2 500 IU,多黏菌素600 IU,杆菌肽2 500 IU。

1.2.2 细菌的分离培养 无菌取5头奶牛流产胎儿和3只流产羊胎儿的肝、脾、肺、胎衣,以及母体阴道分泌物,分别划线接种于双份布鲁菌琼脂培养基,1份置于普通大气37℃培养,另1份置于体积分数为5%～10%的CO2环境37℃培养3 d,如无菌落生长,则继续培养7 d～15 d。取出培养皿,观察菌落生长情况。对可疑菌落涂片并进行革兰染色和改良柯氏染色[4],显微镜下观察形态,进一步用胰蛋白胨培养基(含50 mL/L犊牛血清)对其进行纯化培养,将不同来源的可疑菌进行编号标记。

1.2.3 生化试验 按生化试验管使用说明书对分离纯化的细菌分别做尿素酶活性试验、糖发酵试验(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖)、MR试验、VP试验、明胶液化试验、柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验、触酶试验及石蕊牛乳试验。

1.2.4 血清学试验 分别挑取纯培养48 h后的疑似布鲁菌菌落,利用布鲁菌阳性血清和阴性血清作玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。结果判定方法如下:待菌体和抗血清混合1 min～2 min后,肉眼观察是否出现凝集反应,出现凝集颗粒表明反应呈阳性;不出现凝集颗粒表明反应呈阴性。

1.2.5 种及生物型鉴定 将分离纯化的布鲁菌分别做染料抑制试验、硫化氢产生试验、因子血清A、M、R凝集试验以及噬菌体裂解试验,详细记录试验结果。

2 结果

2.1 分离培养结果

在双料固体平板上培养,该菌生长缓慢,初代培养完全形成菌落在3 d～7 d,在7 d之后形成明显菌落,并在体积分数为5%～10%的CO2环境中容易生长。细菌经传代后,生长速度加快。固体培养物上形成S型菌落。菌落呈圆形、隆起、表面光滑,半透明状,大小为1 mm～2 mm。分离纯化后,染色结果显示,该菌为革兰阴性球杆菌,多数以单个存在,少有成双或链状排列,改良柯氏染色菌体呈红色。

2.2 生化鉴定结果

对不同病料分离出的多株菌进行纯培养,并分别接种于各种生化培养基上,进行生化特性鉴定,结果表明,有4株菌符合布鲁菌的生化特性[5](表1),被分别命名为 M3171、M3252、M3253和 A3313,其中M3171、M3252、M3253分离自绵羊流产胎儿,A3313分离于奶牛流产胎儿。

2.3 血清学试验结果

血清学试验结果表明,4株菌与阳性血清反应均在1 min～2 min内出现肉眼可见的凝集反应,而与布鲁菌阴性血清均未出现凝集颗粒,呈阴性反应,与生理盐水亦无无凝集现象。

2.4 菌种及生物型鉴定结果

利用染料抑制试验、硫化氢产生试验、因子血清A、M、R凝集试验对分离到的4株布鲁菌进行种型鉴定,鉴定结果见表2。确定A3313为布鲁菌牛种生物 3型;M3317、M3252、M3253为布鲁菌羊种生物3型菌。

表1 疑似布鲁菌生化鉴定结果Table 1 Biochemical identification results of suspected Brucella

表2 布鲁菌种和生物型鉴定结果Table 2 Species and type identifition results of Brucella strains

3 讨论

布鲁菌病是危害人、畜健康的重要细菌性传染病,准确的病原诊断是有效防控该病的前提条件,其中病原分离和鉴定是该病准确诊断的经典方法。本试验通过奶牛和绵羊流产胎儿肝、脾、肺及母牛阴道分泌物等病料进行了病原菌的分离和鉴定。通过病料及培养物形态观察、培养特性、生化试验、血清学试验、布鲁菌的种及生物型鉴定,分离获得了4株布鲁菌,其中分离于绵羊流产病料的3株布鲁菌为羊种布鲁菌生物3型;分离于奶牛流产病料的1株菌为牛种布鲁菌生物3型,细菌学鉴定结果表明内蒙古地区奶牛和绵羊中存在牛种和羊种布鲁菌,其鉴定结果不但丰富了本地区布鲁菌病的流行病学资料,不同种及生物型的确定也为科学预防本病提供了重要依据。

布鲁菌病的诊断有多种方法,常规方法包括血清凝集试验、补体结合试验、变态反应性诊断以及细菌学检查等,分子生物学方法包括 PCR扩增法、DNA同源性研究、NA限制性内切酶图谱分析、核酸探针检测法等[6-9]。每种诊断方法各有特点,相互补充。其中,病原分离鉴定时间相对较长、敏感性较低,人员操作过程中又具有潜在的危险性,但因细菌学检查的特异性强、准确性高而成为布鲁菌检查的经典方法,且细菌学检查也是进行病原特性研究的基础;分子生物学方法快速、准确,能够降低人员感染的危险性。目前,布鲁菌病法定的检测方法仍然以病原学和免疫学为主,但随着检测技术的发展完善,分子生物学方法也会成为非常重要的检测手段。

据统计[10],内蒙古自治区除阿拉善盟外,有11个盟市53个旗县分离到了布鲁菌,其中羊种菌与牛种菌共栖的疫区有包头市、呼和浩特市、呼伦贝尔盟、锡林郭勒盟;羊、牛、猪种菌共栖的疫区有哲里木盟;羊、牛、犬种菌共栖的疫区有赤峰市;其他为羊种菌疫区。20世纪 90年代以前,有羊、牛、猪、犬4个种 9 个生物型,即羊 1、2、3 型,牛 1、3、6、9 型,猪 1型和犬种菌,以及羊种和牛种的R型及非典型菌。本试验在呼和浩特地区分离到的牛种和羊种布鲁菌均为3型,与先前报道相一致。2008年,解英波等[11]在呼和浩特市、包头市、通辽市、海拉尔市等地的奶牛中也分离到了布鲁菌病,说明近年来动物布鲁菌病的感染情况形势严峻,人布鲁菌病也时有报道。因此,对动物布鲁菌病的研究和防控重在坚持、不能松懈,要做到早发现、早处理,在引进国外动物时应加强检疫监管,将病畜杜绝于国门之外。

[1]Corbel M J.Recent advances in brucellosis[J].J Med Microbiol,1997,46:101-103.

[2]尚德秋.布鲁氏菌病流行病学研究现状[J].中华流行病学杂志,1998,19(2):107-110.

[3]Bowden R A,Cloeckaert A,Zygmunt M S,et al.Evaluation of immunogenicity and protective activity in BALB/c mice of the 25 kDa major Outer membrane protein ofBucella melitensis[J].J Med Microbiol,1998,47:36-48.

[4]姚火春.兽医微生物学实验指导[M].北京:中国农业出版社,2002:36-42.

[5]黄海波.布鲁氏菌病实验室诊断技术[M].3版.北京:气象出版社,1989.

[6]雷连成,陈 伟,王兴龙,等.布鲁氏菌鉴定和检测方法研究进展[J].动物医学进展,2002,23(2):22-24.

[7]王胜昌,邵伟娟,谢建云,等.布氏杆菌 PCR检测方法的建立[J].上海实验动物科学,2003,23(3):154-155.

[8]乌伦吉如嘎.奶牛布鲁氏菌病病原分离及PCR快速检测方法的研究[D].内蒙古呼和浩特:内蒙古农业大学,2006.

[9]唐浏英,尚德秋,李元凯,等.应用分子生物学技术检测布氏菌抗原的研究[J].中国地方病防治杂志,1995,10(4):199-201.

[10]孙忠强,孙天志.内蒙古布鲁氏菌种型分布和变化[J].预防医学文献信息,1997,3(3):205-206.

[11]解英波,姚 静,乌日罕,等.内蒙地区牛乳中布鲁氏杆菌的分离鉴定[J].中国动物检疫,2008,25(2):31-32.

Identification of Species and Type ofBrucellaEpidemic Strains in Huhhot

ZHAO Lin-li1,TANG Tai-shan2,ZHAO Zhi-guo1,WANG Hai-yan1,AO Wei-hua1,LIU Hong1

(1.Inner Mongolia Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Huhhot,Inner Mongolia,010020,China;2.J iangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing,J iangsu,210001,China)

4 strains ofBrucellawere isolated from aborted fetuses of cattle and sheep which were suspected with brucellosis by conventional bacteriological methods.Based on bacterial morphology,cultural characteristics,biochemical characteristics,and the slide agglutination test and other test,the species and type ofBrucellastrains were identified.The results showed that 3 strains of 4 were biological type 3 ofBrucella ovis,1 strain was biological type 3 ofBrucella abortus.This study has laid an important basis in etiology for the prevention and control of brucellosis in Inner Mongolia.

isolation;identify;biological type 3 ofBrucella ovis;biological type 3 ofBrucella abortus

S852.614

A

1007-5038(2011)09-0034-03

2011-03-15

国家质检总局科技计划项目(2008IK004)

赵林立(1958-),女,河北人,研究员,主要从事食品微生物学及动物疫病快速检测研究。