猫病毒性鼻气管炎PCR检测方法的建立与应用

屈 哲,徐镔蕊,睢艳平,王 勇,杜 艳

(1.中国药品生物制品检定所,北京东城100050;2.中国农业大学动物医学院,北京海淀100193)

猫病毒性鼻气管炎(FR)又称猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)可引起猫的上呼吸道感染,是一种猫的常见的急性、高度接触性上呼吸道疾病[1-2]。病猫精神沉郁,打喷嚏,食欲下降,结膜炎,浆液性的眼鼻分泌物,体温升高,深部的气管咳嗽[3]。慢性感染病例舌头和上颔出现溃疡。FHV-1只感染猫及猫科动物,主要侵害幼猫,发病率达 100%[4],死亡率约为50%[5]。若怀孕猫感染,可造成流产[6]。

猫鼻气管炎病毒(FRV)是1958年Crandell等首次从美国分离[7]。随后相继发现于加拿大、英国、荷兰等地。目前,我国FHV-1发病率呈上升趋势,多次发现临床可疑病例。但兽医临床还只依靠传统的诊断方法,诊断结果不准确,实验室诊断也主要依靠病毒分离和血清学方法[8],过程费时、费力。而聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)具有敏感、特异、快速的优点[9],特异性PCR检测方法的建立,对预防,治疗及根除FHV-1有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料 猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)、猫细小病毒(FPV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV),均由本实验室分离保存。试剂 Taq DNA聚合酶,Marker-DL-2 000,PEASY-T1载体和March1-T1菌液(北京全式金生物技术有限公司),dNTPs,Buffer(MgCl2),随机引物(北京优博基因科技有限公司提供合成)。

1.2 引物 根据GenBank中注册的FHV-1-TK基因,借助 Primer Premier5.0软件,设计针对FHV-1TK基因部分片段的引物:P1 5′-CGCTTGAGGACAGCATAA-3′,P2 5′-TGGGAAACAGACCAGA GA-3′,由北京优博基因科技有限公司合成。

1.3 提取DNA 含有病毒的分泌物溶于灭菌生理盐水,离心弃上层液体后加入裂解液和蛋白酶 K 56℃水浴消化2 h以上,用 Tris饱和酚和酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)除蛋白质。无水乙醇和3 mol/L醋酸钾沉淀DNA。离心弃上清,干燥后加入灭菌双蒸水制成样品待用。

1.4 PCR 扩增 20 μ L 反应体系 :样品 2 μ L,上下游引物 1 μ L,dNT Ps 2 μ L,10 ×Buffer(MgCl22 μ L,Taq DNA聚合酶0.3 μ L,灭菌双蒸水加至 20 μ L。PCR程序:94℃3 min,94℃1 min,52℃45s,72℃45s,30个循环后72℃作用10 min。反应结束后,取3 μ L PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.5 敏感性试验 从眼分泌物中提取的病毒DNA在紫外分光光度计上测定浓度,20 μ L体系中含DNA 量约为 3 μ g,按 10-1至 10-6作 10倍连续稀释,再作为模板加入该PCR反应体系中进行PCR扩增。

1.6 特异性试验 从FHV-1、FPV、FIPV的病毒保存液中提取病毒DNA,加入该PCR反应体系进行扩增,检测该方法的特异性。

1.7 重复性试验 用该方法重复3次各检测8份FHV-1阳性样品和2份阴性样品,比较其重复性。

1.8 PCR产物测序 将1.2.4中得到的PCR产物回收纯化后连接到PEASY-T1载体上并转化感受态细胞March1-T1,筛选出4个可疑重组质粒菌落做PCR扩增均得到目的片段,送往Invitrogen公司进行测序。

1.9 临床病例检测 取28例临床可疑病例的猫眼鼻拭子,用该PCR方法进行检测并统计出检测的阳性率。

2 结果

2.1 敏感性试验 PCR结果表明,该引物能检测出的最低FHV-1 DNA量约为300 pg(图1)。

图1 FHV-1 PCR敏感性试验结果

2.2 特异性试验 将FHV-1、FPV、FIPV和阴性分泌液中提取的DNA PCR扩增后只有FHV-1毒株可扩增出特异性条带,片段长度约537 bp。与预计的片段长度相符合。而其他毒株和阴性分泌液均未出现特异性条带(图2)。

图2 FHV-1 PCR特异性检测结果

2.3 重复性试验 用该方法重复3次检测8份阳性FHV-1样品,结果3次试验中8份阳性样品均扩增出特异性片段,说明该方法具有可重复性。

2.4 产物序列分析 将PCR产物序列测定结果与GenBank上收录的所有FHV-1TK基因部分序列作同源性分析,结果发现同源性达100%。证明PCR扩增片段属FHV-1的特异性片段。

2.5 临床病例检测结果 将28个临床可疑病例分为4组,应用上述该PCR方法进行检测,检测结果。总共有25例检测出FHV-1阳性,阳性率约为89.3%。

3 讨论

近几年,在我国临床上猫病毒性鼻气管炎的发病率迅速上升,而检测FHV-1却主要依靠临床表现及发病史进行诊断,其诊断结果不确实,实验室诊断也只停留在病毒分离和血清学诊断,但其操作繁琐、诊断时间长、结果重复性不好等。PCR技术具有特异性强、灵敏度高、快速简便及重复性好等优点。本试验首次根据GenBank中注册的FHV-1 TK基因序列,设计1对针对FHV-1的特异性引物,并不断摸索优化PCR的反应条件和反应程序,建立了一种快速、敏感、特异性强的FHV-1 PCR检测方法。

FHV-1的TK基因是FHV-1的特异性基因序列,通过PCR方法扩增TK基因部分序列可以用于确诊FHV-1。特异性试验结果显示537 bp处出现特异性的扩增条带,其测序结果与已注册的FHV-1 TK基因部分序列同源性100%,而FPV和FIPV以及阴性分泌液均未扩增出特异性片段,因此,此PCR方法具有较高的特异性。本试验建立的PCR检测方法的敏感性试验能检测出的最低DNA量约为300 pg,灵敏度较高。

本研究建立的FHV-1 PCR检测方法可通过采集病猫的眼鼻分泌物对临床出现的可疑病例进行检测,其检测过程快速简便,检测结果准确性高。本实验室已将该检测方法应用于临床检测,检出的阳性率较高。本方法的建立使本试验室分离、纯化以及保存了猫疱疹病毒,为今后研究疱疹病毒及疫苗的开发打下基础,对我国现今发病率迅速上升的猫病毒性鼻气管炎的防治有重要意义。

[1]Yokoyama N,Maeda K,Tohya Y,et al,Pathogenicity and vaccine efficacy of a thy midine kinase-deficient mutant of feline herpesvirus type1 in cats[J].Arch Virol,1996,141:81-494.

[2]Fujita K,Maeda K,Yokoyama N,et al,In vitro recombination of feline herpesvirus type1[J].Arch Virol,1998,143:25-34.

[3]利凯,徐彤,刘朗,等.猫上呼吸道感染性疾病的诊疗[J].中国兽医杂志,2005,41(3):37-38.

[4]Povey R C.A review of feline viral rhinotracheitis(feline herpesvirus 1 infection)[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis,1979,2:373-387.

[5]Roger K Maes,Sandra L Fritsch,Lori L.Immunogenic Proteins of Feline Rhinotracheitis Virus[J].Journal of Virology,1984,7:259-262.

[6]Roizman B,Carmichael L E,Deinhardt F,et al,Herpesviridae;definition,provisional nomenclature and taxonomy[J].Intervirology,1982,16:201-217.

[7]Crandell R A,Maurer F D.Proc Soc Exptl Biol[J].Med.97,1958,487.

[8]J Ditchfield.Discussion and Preliminary Peports[J].Viol,1965,26:504-506.

[9]萨姆布鲁克J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].黄培堂,译.3版.北京:科学出版社,2002.