细菌16S rDNA基因芯片的构建及应用

林居纯,曹三杰,蒋红霞,曾振灵

(1.华南农业大学兽医学院广东省兽药研制与安全评价重点实验室,广东广州510642;2.四川农业大学动物医学院,四川 雅安 625014)

细菌性感染一直危害着畜禽健康,对病原菌做出快速准确诊断是控制疾病发展前提。细菌常规鉴定所需时间长,尤其对生长缓慢或难以培养病原菌要做出及时正确诊断显得更加困难。随着分子生物学发展,PCR技术已被用于临床检测病原菌,但常规PCR需设计针对病原菌的特异引物,对分离未知细菌或混合感染,则难以实现快速诊断目的[1-2]。

本试验利用细菌种系发育过程中具有重要意义的16S rDNA基因为检测靶点,构建了细菌16S rDNA基因芯片,并对兽医临床重要病原菌进行了检测,为实现基因芯片技术应用于兽医临床提供初步研究。

1 材料与方法

1.1 标准菌株 大肠杆菌ATCC25922(Escheria coli)、沙门菌 C79-13(Salmonella pullorum)、金黄色葡萄球菌ATCC25923(Staphylococcus aureus)、无乳链球菌CVCC1887(Streptococcus agalactiae)、鸡毒支原体 PG31(Mycoplasma gallisepticum)由本实验室保存提供。

1.2 主要试剂及仪器 质粒DNA提取试剂盒购自Omega Bio-tek公司;PCR相关试剂及pMD18-T载体购自TaKaRa公司;氨基基片、杂交缓冲液等购自上海百傲科技有限公司;Cy3-dCTP购自Amersham Biosciences;Lambda定位基因由四川农业大学基因芯片实验室提供;SpotArrayTM24芯片点样仪、ScanArray·4000扫描仪购自Packard Bioscience公司;PX2梯度PCR仪购自Thermohybaid公司;2000型凝胶电泳图像分析系统、Smart SpaceTM3010核酸蛋白检测仪购自Bio-RAD公司。

1.3 引物设计 参考E.coli等5种微生物16S rDNA序列,设计扩增16S rDNA V1-V3区490 bp片段的通用引物。引物序列16S1:5′-AGGCCTAACACATGCAAGT-3′,16S2:5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。

1.4 靶基因克隆、鉴定及制备 将 E.coli ATCC25922等5种标准菌株,采用水煮沸法提取DNA用作PCR模板。PCR体系:dNTP(各 2.5 mmol/L)5.0 μ L,Ex Taq(5 U/μ L)0.25 μ L,10 ×ExTaq Buffer 5.0 μ L,引物 16S1 和 16S2(10 μ mol/L)各 1.0 μ L,模板 2.0 μ L,加 ddH2O 至 50 μ L 。 反应参数:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸25 s,共30个循环,72℃延伸5 min。将PCR产物回收克隆到pMD18-T后转化大肠杆菌JM109,送TaKaRa公司测序。

提取重组质粒DNA为PCR模板,按上述PCR扩增条件扩增靶基因。靶基因PCR产物纯化后,用紫外核酸蛋白仪测定其浓度及纯度。

1.5 16S rDNA基因芯片制备 将纯化后靶基因PCR产物和定位基因稀释至200 mg/L,用SpotArrayTM24接触式芯片点样系统在氨基化基片上点样。点样阵列为1～6行分别为E.coli、Salmonella、S.aureus、S.agalactiae、M.gallisepticum 和Locted gene,每行 12点,各样点中心间距为 650 μ m,样点直径为220 μ m。将点制好芯片静置于点样仪上过夜干燥,经水合,紫外交联,洗涤及离心干燥后密封,室温保存。

1.6 探针制备 采用Cy3-dCTP随机渗入标记法制备探针。标记体系内含 dA+T+GTPmixture(各 10 mmol/L)3 μ L,dCTP(10 mmol/L)0.5 μ L,Cy3-dCTP(0.25 mmol/L)0.5 μ L,Ex Taq(5 U/μ L)0.5 μ L,10 ×Ex Taq Buffer(Mg+Plus)5.0 μ L,引物 16S1 和 16S2 各 1.0 μ L,模板 DNA 2.0 μ L,加 ddH2O 至 50 μ L。PCR参数同1.4。

1.7 芯片杂交及数据分析 基因芯片于95℃水浴变性3 min后转置95%冰冷乙醇中冷却,1 000 r/min离心干燥5 min。在芯片点样区加25 μ L预杂交液42℃预杂交1 h,将变性探针及标记定位基因混合液20 μ L加于芯片点样区,47℃杂交3 h。杂交结束后,分别以1、2号和3号洗液洗涤芯片 3～5 min,三蒸水漂洗 3 min,离心干燥后基因芯片扫描仪扫描。阳性信号判断采用样点信号总强度值≥1.5倍背景强度值,即SNR≥1.5,同时结合信号强度中位值(intensity)＞1 000或扫描图像上杂交斑点明显可见为判断标准[3]。

1.8 基因芯片特异性及灵敏度试验 将5种标准菌制备的探针及定位基因标记物,分别与芯片杂交,以检测芯片特异性。将S.aureus ATCC25923制备的探针稀释成系列浓度:1,3,30,300,3 000,9 000,27 000 μ g/L,分别与芯片杂交,经荧光扫描仪扫读信号,以检测基因芯片杂交系统灵敏度。

1.9 临床样品检测 102份临床样品经培养后,对疑似菌株分别进行基因芯片检测、常规生化鉴定及血清学鉴定,以比较芯片检测与常规细菌学检测结果的一致性。经常规细菌学鉴定的菌株,按2种、3种及4种方式将不同种类菌制成混合样品,与芯片杂交,以判断芯片对多个样品同时检测的可行性。

2 结果

2.1 靶基因的扩增和序列分析 通用引物扩增E.coli等5种不同微生物,均获得约490 bp片段。PCR产物测序结果显示,扩增片段为细菌16S rDNA V1-V3 区片段 ,E.coli、S.pullorum 、S.aureus、S.agalactiae和M.gallisepticum与GenBank序列同源性分别为98.8%、98.8%、99.8%、98.6%和98.2%。

2.2 基因芯片特异性试验及灵敏度试验 5种探针和定位基因标记物,在相同杂交条件下分别与基因芯片杂交结果显示,除大肠杆菌和沙门菌探针与基因芯片杂交有交叉杂交外,其他探针与芯片杂交特异性高(见中插彩版图1)。灵敏度试验表明,当靶基因浓度为 200 mg/L时,探针浓度为 3 μ g/L时,其杂交信号Media intensity为2056,SNR值为1.654,而探针浓度为 1 μ g/L时,信号总强度值低于背景总信号强度值,这表明所构建芯片系统灵敏度为 3 μ g/L 。

2.3 临床样品检测结果 不同鉴定方法对102份临床样品的检测结果见表1。从表1可见基因芯片对S.aureus、Streptococcus和 M.gallisepticum 鉴定结果与传统生化试验和血清试验结果一致,但对于大肠杆菌和沙门菌不能鉴定。基因芯片对于S.aureus、Streptococcus和M.gallisepticum2种或 3种菌混合样能同时检测,但对大肠杆菌或沙门菌混合样不能正确检测。

表1 不同方法检测102份临床样品结果

3 讨论与结语

实现细菌通用检测,一直是临床诊断所需解决的热点问题,寻找适合靶分子又是实现细菌通用检测的关键。16S rDNA基因常以多拷贝形式存在于原核生物中,分为可变区和恒定区,其中可变区包含种间差异信息使其具有特异性,恒定区决定了检测的稳定性,多拷贝存在形式使检测具有敏感性,故常选用16S rDNA作为原核生物检测靶点[4]。本试验比对了兽医临床常见5种微生物16S rDNA序列,在恒定区设计通用引物,扩增大肠杆菌等16S rDNA V1-V3可变区,PCR产量高特异性强,且制备了16S rDNA PCR产物基因芯片,用于检测兽医临床常见5种病原菌。

基因芯片特异性试验及对临床分离样品检测显示,本次制备的16S rDNA芯片能鉴定S.aures、Streptococcus、M.gallisepticum 3 种微生物,特异性高;对102份临床样本中的1株S.aures,3株Streptococcus,3株M.gallisepticum进行了正确鉴定,与生化和血清学鉴定结果符合率达100%;对于混合样,能检测其中的 S.aures、Streptococcus、M.gallisepticum 3种菌株,对E.coli和Salmonella样本基因芯片杂交结果不理想,存在交叉杂交,原因是E.coli和Salmonella的16S rDNA同源性高达90%以上,在系统进化树上同属很小的分枝,一般认为同源性大于80%的基因交叉杂交高达26%～57%,基因片段重叠和同源性高是引起交叉杂交的原因[5]。因此提示了16S rDNA PCR产物芯片,尽管省钱、省事,杂交后信号强,灵敏度高,但进行同一科、属内菌株的鉴定很难达到理想效果,所以对基因同源性非常高细菌进行鉴别,最好结合细菌相关毒理基因,设计特异性引物进行扩增和杂交,或使用寡核苷酸探针,按通用探针和针对细菌科、属和种特异性探针联合的方式,才有可能达到理想的鉴定效果[6-7]。

本次制备的16S rDNA基因芯片,成功地鉴定了兽医临床常见的 S.aures、Streptococcus、M.gallisepticum 3种病原菌,对于这3种菌株混合样也能正确鉴定,基因芯片系统灵敏度达3 μ g/L,但对于同源性非常高的E.coli和Salmonella不能鉴定。下一步的研究工作将扩大探针的数目,特别是能区分同一科属细菌的特异性探针,同时扩大病原菌检测范围,优化杂交体系和条件,加快基因芯片技术的实用化研究进程。

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