牛源金黄色葡萄球菌16S rRNA分子鉴定与随机多态性扩增分型

邓海平,蒲万霞 ,梁剑平,倪春霞,孟晓琴

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院新兽药工程重点开放实验室甘肃省新兽药工程重点实验室,甘肃兰州730050)

奶牛乳房炎是一种主要由病原微生物引起的奶牛常见病,是造成奶牛养殖业生产经济损失的重要因素之一,不仅影响奶牛养殖业、乳品工业的发展。金黄色葡萄球菌感染是引起奶牛乳房炎最主要的原因之一,乳房炎奶样中其检出率均在30%以上[1-2]。及时准确的掌握病原菌的种类和分子流行病学趋势对于该病的临床治疗和疫苗的研制都非常重要。随着分子生物学的发展,越来越多的分子生物学方法被应用于病原菌的鉴定和分子流行病学研究,16S rRNA保守序列就是常用于细菌鉴定分子标记之一。DNA随机多态性扩增(random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术是一种简便、灵敏可行的新的遗传标记技术。该技术问世后迅速在国内外被广泛应用于微生物的基因分型与鉴定[3-4]。近年来有关金黄色葡萄球菌基因分型的研究主要集中于人医来源的菌株,畜源菌株的基因分型研究相对较少。本试验利用16S rRNA保守序列对引起内蒙古地区奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌进行鉴定及RAPD基因分型研究,探讨该地区金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎分子流行病学特点,为我国奶牛乳房炎基因工程疫苗的研制提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 DNA Ladder Marker(分子量依次为4 500 bp,3 000 bp,2 250 bp,1 000 bp,750 bp,500 bp,250 bp)、DL 2 000 Marker、Premix Ex Taq酶等购自宝生物工程(大连)有限公司;DNA提取试剂盒购自Tiangen生物制品公司;金黄色葡萄球菌标准菌CVCC2246购自中国兽医药品监察所;基因扩增仪(Biometra,UK),DYY-8C型电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.2 金黄色葡萄球菌分离鉴定

1.2.1 细菌纯化培养 100份临床型乳房炎患牛奶样分别来自内蒙古地区3个奶牛场。奶样接种于绵羊血平板培养基和却甫曼琼脂培养基做纯化培养。

1.2.2 金黄色葡萄球菌生化鉴定 将菌落形态、镜检结果符合葡萄球菌特征的菌株参考相关生化特性进行金黄色葡萄球菌生化鉴定。

1.2.3 金黄色葡萄球菌分子生物学鉴定 根据已发表的金黄色葡萄球菌的16S rRNA基因保守序列(GenBank登录号 X68417),设计合成引物:P1:5′-GCGGTCGCCTCCTAAAAG-3′,P2:5′-TCCCGGTCCTCTCGTACTA-3′。提取菌落形态、镜检结果符合葡萄球菌特征菌株基因组DNA作为模板进行PCR扩增,扩增产物-20℃冻存。

1.3 金黄色葡萄球菌分离株RAPD基因分型 选择序列 OLP13:5′-ACCGCCTGCT-3′,作为扩增引物。采用25μ L反应体系,PCR循环参数分别为:94℃5 min,37℃5 min,72℃5 min,循环4次;94℃1 min,37℃1 min,72℃2 min,循环 30次;72℃延伸10 min。扩增产物-20℃冻存。

1.4 扩增产物凝胶电泳分析 取分子鉴定及RAPD扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳,电泳结果用凝胶成像系统紫外成像。

1.5 数据分析 利用BioNumerics软件对RAPD扩增电泳结果进行数据处理,图像采用Dice相关系数和非加权组算术平均法来进行聚类分析。

2 结果

2.1 菌株分离鉴定结果 菌株经生化鉴定,符合金黄色葡萄球菌生化指标菌株为35株。经16S rRNA基因PCR扩增后,有35株菌产生了450 bp左右的目的片段(图1)。表明生化鉴定结果与分子鉴定结果完全一致。对鉴定为金黄色葡萄球菌的菌株进行编号N01～N35。菌株在3个牛场的分布情况如表1。

图1 金黄色葡萄球菌16S rRNA鉴定结果

表1 金黄色葡萄球菌分离鉴定结果

2.2 RAPD扩增结果 对35株金黄色葡萄球菌基因组DNA模板进行RAPD扩增。结果显示,所有菌株基因组DNA经扩增后均产生了清晰、可分辨的带谱,扩增产物在1～8条带之间,具有多种带型组成(图2)。

2.3 RAPD产物的遗传相关性分析 利用Bio-Numerics分析软件对35株金黄色葡萄球菌染色体DNA的RAPD产物电泳图谱进行聚类分析,建立了亲缘关系聚类图(图2)。由图2可以看出,以相似性40%为标准(虚线所示),35株临床获得的金黄色葡萄球菌根据其遗传差异分为6个聚类群。其中Ⅰ型2株(占 5.7%),Ⅱ型 3株(占 8.6%),Ⅲ型6株(占17.1%),Ⅳ型 15株(占 42.9%);Ⅴ型 5株(占14.3%)、Ⅵ型5株(占14.3%)。

3 讨论

3.1 奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌分离鉴定 金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要传染性病原菌之一,由其引起的炎症具有传染性强和难治愈的特点[5]。快速准确的掌握引起奶牛乳房炎病原菌的种类和分布是防治奶牛乳房炎和疫苗研制的首要条件[6]。随着分子生物学技术的发展,通过细菌保守序列PCR扩增来确定其种类的方法被越来越多的应用于病原微生物的分离鉴定。本试验利用了金黄色葡萄球菌16S rRNA高度保守序列设计了对应引物对奶样中分离出的金黄色葡萄球菌进行了分子鉴定,并与传统方法鉴定结果进行了比较。结果表明,两种方法的鉴定结果完全吻合。但是分子鉴定的方法只需1～2 d即可得出结果且具有较高的特异性,缩短了细菌性奶牛乳房炎的诊断时间,为及时的临床治疗提供了保障。

3.2 奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌RAPD基因分型

RAPD是近年来兴起的一种新的揭示基因多态性的基因分型方法,其特点是不需预先知道有关基因序列,只需采用通用的随机引物对基因组DNA进行扩增,利用扩增产物指纹图谱进行基因分型。据国外研究报道,利用RAPD方法对医院分离的金黄色葡萄球菌进行分型并与PFGE方法分型结果进行比较后发现两种方法分辨力相当且分辨结果高度一致[7-8]。说明RAPD与PFGE在金黄色葡萄球菌分型方面具有相同的高效性。

本试验对采自内蒙古地区乳房炎奶样中的35株金黄色葡萄球菌进行了RAPD分型。从 RAPD产物指纹图上可以看出,所有菌株染色体DNA扩增后均得到了清晰可分辨的条带,具有多种带型组成,清楚地反应了菌株间的基因多态性特征。聚类分析树状图结果将35株菌分为了6个基因型,其中Ⅳ型菌株占了总数的40%以上,为该地区主要流行的优势菌群。15株Ⅳ型菌中有13株相似性在85%以上且均含有大小约2 000 bp的一条片段,推测这些菌株可能是来自于同一亲本不同克隆的菌株。根据不同基因型菌株在3个牛场的分布可以看出,除了牛场C外,其他两个牛场中的金黄色葡萄球菌均有各自明显的流行优势菌群。说明菌株在各牛场之间有广泛流行传播,但是地区间菌株基因型还是有一定的特异性。牛场C中菌株分为4个基因型且分布较平均,这可能与该牛场卫生环境较差,奶牛乳房炎发病率高,病原菌流行广泛有关。

应用RAPD技术对畜源病原菌进行快速流行病学调查,为兽医传染病分子流行病学研究提供了可行的研究方法,其在兽医分子流行病学和传染病学等领域具有较广阔的应用前景。

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