细胞凋亡相关的斑点样蛋白与半胱氨酸蛋白酶-1在淋巴瘤中的表达及临床意义

江兴林，左云飞

1.怀化医学高等专科学校，湖南怀化 418000；2.大连医科大学，辽宁大连 116044

细胞凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosis-associated specklike protein，ASC）是含有胱天蛋白酶募集结构域（caspase recruitment domain，CARD）的与细胞凋亡相关的蛋白活化因子，细胞凋亡或程序性细胞死亡是正常发育和体内稳态的必要过程[1]。很多研究证实在许多肿瘤中，肿瘤样改变和肿瘤细胞的生长与细胞凋亡的抑制密切相关。有报道在一些肿瘤细胞株中ASC表达增高时能导致细胞凋亡，并且其定位可使细胞溶质结构更清晰[2]；细胞凋亡程序被触发后，执行细胞凋亡程序，需依赖Caspase（半胱氨酸蛋白酶）家族的激活[3-5]。因此，ASC、Caspase家族在细胞凋亡的信号通路中均具有重要作用。已有研究表明ASC表达增高能通过肿瘤坏死因子和活化caspase-8使凋亡信号放大[6]。同时有研究证实，ASC基因启动子的频繁甲基化在前列腺癌、肝癌、乳腺癌及黑色素瘤中普遍存在[3-4，7-8]。说明ASC基因被甲基化而不表达，不能触发细胞凋亡，从而导致癌的发生。该基因编码的衔接蛋白ASC还参与免疫反应、炎性反应的信号转导通路，通过Caspase结构域与Caspase-1结合，进一步使Caspase-1活化，引起致炎细胞因子、IL-1和IL-18的激活与分泌，实现对肿瘤的抑制。本实验通过对淋巴瘤及癌旁组织中ASC、Caspase-1的表达情况采用免疫组织化学方法测定，探讨其表达跟淋巴瘤发生和发展及与临床的联系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

从大连医科大学附二院和湖南肿瘤医院选取1995年1月～2007年1月通过病理学证实的淋巴瘤和相应癌旁组织石蜡包埋标本各30例，术前均未接受放、化疗，其中，男21例，女9例；年龄33～85岁，平均47岁。由病理医师对切片进行复查确诊，按Dukes分期进行临床病理分期，其中，A期6例，B期15例，C期6例，D期3例。

1.2 方法

免疫组化操作按LSAB免疫组化试剂盒说明进行，阴性对照中一抗采用PBS代替，阳性对照采用已知的阳性标本。具体操作：石蜡切片依次用二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇、自来水洗脱蜡水化，98℃枸橼酸钠液中修复抗原，3%H2O2消除内源性过氧化物酶。正常山羊血清封闭非特异性抗原，分别滴加 ASC、Caspase-1 一抗（1∶200 稀释），4℃冰箱过夜，滴加生物素标记的二抗。加入LSAB复合物。DAB显色，苏木素染液复染，65℃水中蓝化，依次在75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯中脱水，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.3 观察指标

阳性细胞为在细胞中染棕黄色。随机观察5个高倍视野（×400），计算阳性细胞数百分比。 ASC、Caspase-1阳性细胞百分数＜25%为阴性，≥25%为阳性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 11.0软件进行统计学分析，率的比较用χ2检验或 Fisher's Exact Test。

2 结果

2.1 在淋巴瘤及癌旁组织中ASC的表达

ASC阳性染色主要在细胞浆中染棕黄色，胞核少数可见，见图1A。淋巴瘤组织及癌旁组织中ASC阳性率分别为16.67%（5/30）与 76.67%（23/30），组间阳性表达率差异有高度统计学意义（P＜0.01），见表 1。

2.2 在淋巴瘤及癌旁组织中Caspase-1的表达

Caspase-1阳性染色主要在细胞浆中染棕黄色，胞核少数可见，见图1B。淋巴瘤组织及癌旁组织阳性率分别为26.67%（8/30）与 63.33%（19/30），组间阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.01），见表 1。

2.3 在淋巴瘤及癌旁组织中ASC与Caspase-1表达分析

ASC与Caspase-1两指标在淋巴瘤组织中的表达均低，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表2；而在癌旁组织中两指标表达均增高，且高度相关（P＜0.01），见表 3。

3 讨论

SC是一种与细胞凋亡相关的抑癌基因，属于CED4/Apaf1基因家族，其基因定位于16p11.2-12[2]，编码的蛋白质分子量为22 kDa，C-末端含有半胱氨酸蛋白酶募集结构域（a caspase recruitment domain， CARD），是与细胞凋亡信号有关的蛋白质，N-末端为热蛋白样结构域（a pyrin domain，PYD），是参与免疫反应有关的蛋白质。ASC可在许多正常组织中表达，如在结肠组织中，ASC在高分化的上皮细胞绒毛端表达高，这样通过细胞凋亡以维持细胞的不断更新[9]，而ASC在低分化的毛囊细胞中不表达[3]。其他组织如甲状腺、脾、小肠、肺、中性粒细胞、单核细胞等中亦有同样现象，依此可推测，在构建和维持细胞分化状态中ASC可能起作用，与正常上皮细胞的增殖及分化信号相关。提示：在肿瘤细胞和肿瘤组织中ASC表达是降低的。许多研究证实ASC在不同类型细胞凋亡的调节中具有明显的作用，成为癌治疗的新靶点[10]。当ASC表达缺失时组织易发生癌变。如在黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、胆管癌、人类结肠癌细胞株中的研究中均发现由于ASC基因的异常甲基化，导致ASC不表达或表达减少[4-5，11]。同样在肝癌的研究中也发现，具有与ASC的Pyrin结构域同源性很高的蛋白（ASC-Like，ASCL）的编码基因，甲基化程度在肝细胞癌细胞株中高达80%，而在肝细胞正常样本中甲基化不明显。在肝细胞癌样品中，观察到ASCL和ASC的甲基化均为53%。用脱甲基化试剂5′-乙酰唑胺2′-脱氧胞苷酸能使ASCL因甲基化不表达的细胞再生[8]。另外，ASC缺少可激活NF-κB途径，NF-κB激活可引起肿瘤细胞增殖，引起肿瘤在血管生成及转移。在上皮源性肿瘤和白血病、淋巴瘤中，由于ASC基因表达缺失而抑制细胞凋亡，也可能激活NF-κB。表明ASC基因在淋巴瘤中的发展起重要作用，能成为淋巴瘤防治的一个有希望的靶点。本实验的结果显示，在淋巴瘤中ASC的表达显著低于癌旁组织（P＜0.01），跟以往报道的因ASC基因甲基化而在各类癌中表达减少一致。

Caspase为半胱氨酸蛋白水解酶家族，包括3大类型：启动型、效应型和炎症型。与细胞凋亡和机体免疫反应密切相关。其中Caspase-2、8、9、10属于启动型，活化后可启动细胞凋亡和调节效应型 Caspase；Caspase-3、6、7属于效应型，可水解细胞蛋白，引起细胞凋亡；Caspase-1、4、5等属于炎症型，活化后可引起一系列的炎症因子的释放，进一步导致炎症反应[12]。Caspase-1为炎症反应过程的重要作用物质。很多的研究证实，ASC可作为衔接蛋白通过Caspase补充区域（CARD），以CARD/CARD途径与原Caspase-1特异结合，使其活化，然后引起IL-1和IL-18等炎症细胞因子的成熟与活化[11-13]，推测ASC可能通过激活caspase-1信号途径来实现它的抗肿瘤效应。机体可通过免疫系统达到识别和杀死癌细胞之目的。有报道IL-18在多发性鼠肿瘤模型中有显著的抗肿瘤效应。如T细胞受到肿瘤细胞的刺激而活化，或释放细胞因子，活化IL-18、IL-1B，实现抗肿瘤功能。当ASC缺失时，能使免疫细胞活化、增殖和抗肿瘤效应受影响[14]。本实验表明，淋巴瘤组织与癌旁组织中Caspase-1表达存在显著差异（P＜0.01），虽在淋巴瘤组织中ASC与Caspase-1两者表达都减少，但差异不明显（P＞0.05），而在癌旁组织中表达均显著增高（P＜0.01）。结果显示，Caspase-1的表达可能依赖ASC的介导。

表1 在淋巴瘤组织及癌旁组织中ASC、Caspase-1表达结果的比较（例）

表2 在淋巴瘤组织中ASC与Caspase-1表达结果的比较（例）

表3 在癌旁组织中ASC与Caspase-1表达结果的比较（例）

总之，本实验表明在淋巴瘤组织中ASC、Caspase-1表达减少；虽在淋巴瘤组织中2个指标表达都降低，但无相关性；而在癌旁组织中2个指标中表达均增高，且高度相关。提示，在淋巴瘤的凋亡、发生和发展过程中，ASC、Caspase-1与之密切相关，可成为淋巴瘤的诊断及治疗有希望的靶点。

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