拉米夫定和α-干扰素序贯治疗e抗原阴性乙肝患者及其对拉米夫定耐药突变的抑制

宫航宇，綦盛麟，石 铭，宋连平

大连市第六人民医院，辽宁大连 116031

据估计每年大约有3.5亿人感染慢性乙肝，乙肝携带者有更高的风险发展成为肝硬化、肝功能失代偿和肝癌[1-2]。治疗这些患者的长期目标是阻止他们发展成为肝硬化和肝癌。然而这个长期目标在临床上是不实用的。在治疗后1年或更短时间的跟踪中，通常采用更加切实可行的短期目标。较为广泛应用的短期目标是血清ALT水平的复常和血清HBV-DNA水平的降低[3-4]。这些指标反映了肝脏生化水平的改善和病毒复制的抑制。

目前用于治疗慢性乙肝和疗效观察的药物主要分为两大类：免疫调节剂和核苷类似物。α-干扰素是最为熟知的免疫调节剂，拉米夫定是研究最深入的核苷类似物药物[5]。干扰素在白种人身上较为有效，而用于亚洲人则差强人意。拉米夫定对于血清ALT水平的复常、e抗原转阴、血清HBVDNA的下降都很有效。然而长期拉米夫定治疗会导致HBV聚合酶基因YMDD基序突变的产生[6-8]。随着突变病毒株的产生，对拉米夫定治疗越来越有耐药性。在许多研究中，拉米夫定和α-干扰素联合用药被用于克服治疗中耐药性的产生，并且这种疗法可以减少或延迟YMDD突变的产生。拉米夫定和α-干扰素序贯治疗可以诱导对α-干扰素单独治疗无应答的患者产生持续的病毒应答。同时又不会引起耐药突变株的优势选择。序贯联合治疗可以诱导e抗原阴性HBVDNA阳性的乙肝患者产生持续的病毒应答。与联合治疗相比，对乙肝患者采用拉米夫定和α-干扰素序贯治疗的有效性仍需进一步探索。

本研究中，笔者评价了拉米夫定和α-干扰素序贯治疗e抗原阴性乙肝患者的功效，还采用了一种基于Taqman技术的实时PCR方法调查治疗过程中的拉米夫定突变。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究进行于2002年6月～2004年7月，共有162例未经抗病毒治疗的患者进行了该序贯治疗的研究。所有患者均＞16 岁，平均年龄（34.0±11.2）岁；其中，男 108 例，女 54例；HBsAg持续阳性至少6个月、HBeAg阴性、anti-HBe阳性、HBV-DNA水平＞105copies/ml，血清ALT水平高于正常范围的1.5倍，小于10倍（根据中国拉米夫定应用专家共识）。患者排除标准包括乙肝与甲、丙、丁、戊肝以及HIV共感染者、失代偿性肝病或者肝癌患者、1年内有酒精或毒品滥用史者、其他可能引起慢性肝损伤的原因以及经过治疗的乙肝患者。

患者治疗前的基本信息见表1。98例患者根据随机安排接受拉米夫定治疗，64例患者接受拉米夫定和α-干扰素的序贯治疗。

1.2 研究设计和治疗方案

按照2∶3的比例将患者随机分为两组。A组64例接受序贯治疗，B组98例接受拉米夫定单独治疗。本研究按照Helsinki指南和GCP条例进行，所有的患者均被告知并表示同意。

表1 患者基本信息

A组患者接受拉米夫定（100 mg/d，葛兰素）治疗20周，然后用α-2b干扰素（500万U，每周3次，先灵葆雅）和拉米夫定（100 mg/d）联合治疗4周，然后再用α-2b干扰素（500万U，每周3次）单独治疗24周。B组患者每日接受100 mg的拉米夫定单独治疗持续48周。在48周治疗结束后，所有患者均继续治疗24周。

1.2 YMDD突变的检测

YMDD突变检测采用我们所创建的一种基于Taqman技术的实时PCR，每隔12周进行一次。在本研究中，我们设计了3个不同的反向引物，可以选择性扩增YMDD（野生型）、YVDD（rtM204V）和 YIDD（rtM204I）以及一个共同的位于HBV聚合酶基因高度保守序列上的正向引物，从而有效区别三种不同的病毒株。扩增子通过一个设计在正向和反向引物之间与高度保守序列互补的Taqman探针在进行实时PCR过程中得到定量检测。一个通用的正向引物被用于扩增所有类型的病毒株作为对照。扩增体系先在50℃反应2 min，然后95℃反应5 min，然后是40个PCR循环：94℃反应20 s，53℃反应30 s。扩增在ABI 7000仪器上进行。

1.3 ALT水平、HBV标志物和HBV-DNA检测

ALT 水平 、HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe 和 anti-HBc采用商品试剂盒每隔30 d检测1次。HBV-DNA水平的检测采用复星诊断的试剂盒在ABI 7000仪器上进行。所用试剂盒均经过SFDA批准用于临床体外检测。

1.4 疗效评价

疗效评价针对本研究中所有随机招募的患者进行。本研究中有两项基本的评价指标。一项是在72周时进行，ALT水平的复常和HBV-DNA水平被抑制至低于1 000 copies/ml的患者比例。

第二项评价指标是在72周时测定患者中HBsAg消失或HBsAg血清转换（定义为HBsAg的消失和anti-HBs的出现）的比例。

1.5 统计学分析

两组间的差异性分析采用χ2检验进行统计。显著性水平设为 P＜0.05。

2 结果

2.1 生化应答

在 24周后，A组 64例患者中血清 ALT复常 28例（44%），B组98例患者中72例（73%）复常。然而在48周后A组中38例（59%）复常，B组中只有54例（55%）保持了持续的生化应答。在24周时B组中ALT水平复常的比例（73%）明显高于 A 组（44%）（P＜0.05），而在 48 周时，两组间没有明显区别。在72周时，A组中ALT水平复常的比例（53%）明显高于 B 组（36%）。

2.2 病毒应答

在24周时，A组HBV-DNA水平小于1 000 copies/ml的比例为81%，B组为78%；而在48周时，A组为56%，B组为55%。两组在血清HBV-DNA抑制方面没有明显差异。在72周时，A组中HBV-DNA水平＜1 000 copies/ml的有9例（14%），B 组有 18例（18%），见表 2。

2.3 HBsAg应答

在72周时，HBsAg消失或血清转换的数据两组均未进行检测确定。

表2 治疗24周、48周和72周时患者的病毒学和生化应答[n(%)]

2.4 拉米夫定耐药突变

没有患者有证据表明在治疗前发生了拉米夫定耐药突变。所有的患者每隔12周进行1次拉米夫定突变检测。A组在24周时，只有2例患者发现有YIDD突变，在48周时没有患者检出YMDD突变。这2例发生YIDD突变的患者在48周和72周时ALT水平复常且HBV-DNA未检出。相比之下，B组中在24周时有6例发生YMDD突变 （4例YIDD突变，2例YVDD突变）。48周时检出22例患者发生突变（12例YIDD突变，8例YVDD突变，2例I/V混合突变）。所有的22例发生突变的患者在48周时都发生血清HBV-DNA的反弹，18例发生了ALT水平的反弹。

2.5 不良反应

拉米夫定具有良好的耐受性且治疗中未产生不良症状。在使用干扰素的过程中，6例患者有严重的不良反应，包括发热、疲劳、肌痛和头痛。本研究中未发现有抑郁症状的患者。治疗过程中，中性粒细胞和血小板数量下降，但是在治疗结束后很快又恢复到基准水平。所有患者都完成了全部治疗过程。

3 讨论

慢性乙肝患者单独用α-干扰素治疗的长期效果不佳，很可能是由于早期机体感染的乙肝病毒所诱导出的对HBV的免疫耐受所致[7-8]。用拉米夫定和α-干扰素序贯治疗对于单独用干扰素无应答的慢性乙肝患者较为有效，主要原因可能是拉米夫定诱导的T细胞对HBV清除活性的恢复和HBV-DNA水平的降低，从而提高了α-干扰素的治疗功效[9-10]。在本研究中，我们发现对于HBeAg阴性患者采用先用拉米夫定后用α-干扰素序贯治疗可以使其产生有效应答，而且在治疗中拉米夫定耐药突变能得以有效抑制。在治疗结束时，序贯治疗的64例患者未发现YMDD突变，而拉米夫定单独治疗的98例患者中有22例产生YMDD变异。

拉米夫定长期用药会诱导YMDD变异的产生，有时还伴随着严重的肝炎症状。以往的研究表明，拉米夫定和α-干扰素序贯治疗能诱导α-干扰素单独用药无应答者产生持续的病毒应答，同时不会产生拉米夫定耐药突变选择[11-12]。二者联合用药以及序贯治疗非常有效，而且能够延迟拉米夫定耐药突变选择。最近的研究表明一种针对年轻乙肝患者的分三个阶段的拉米夫定和α-干扰素序贯治疗能够降低HBVDNA水平，但是不能阻止拉米夫定耐药突变的产生。在我们的研究中，接受拉米夫定和干扰素序贯治疗的患者中56%在治疗结束时血清HBV-DNA转阴。拉米夫定单独治疗的患者中55%转阴。序贯治疗小组中未发现有拉米夫定变异，拉米夫定单独治疗组中有22.45%的患者发生YMDD变异。这些发现与以往的联合用药治疗研究结果相一致。序贯治疗看起来更加有效，并且能抑制拉米夫定耐药突变的产生。

2例患者在序贯治疗24周时发生YIDD突变，但是在48周和72周时，ALT水平复常且血清HBV-DNA未检出。变异在拉米夫定治疗12～24周时产生，在换用α-干扰素治疗后消失。这表明α-干扰素可能对于一些拉米夫定变异患者是有效的。

在24周时，A组的ALT水平比B组高，这可能是由于添加用药α-干扰素引起了21例患者的ALT水平升高。在这21例患者中，6例在72周时表现出持续的生化和病毒应答。笔者不能下结论说在α-干扰素治疗开始时ALT水平的升高延长了应答期。然而在72周时序贯治疗组产生了更高的生化应答率。这可能是由于α-干扰素对于血清ALT水平复常起了重要作用。

本研究的主要不足在于缺少组织学应答的数据。在其他研究中，有较长病毒应答的患者会有组织学上的明显改善。在组织学活性改善与延长的生化和病毒应答之间有着较强的联系。B组中男性比例比A组高，这可能引起治疗功效评价的一些偏差，而且，本研究中持续应答率较低是由于治疗时间相对较短。以后的研究中需要对更长时间的治疗进行评估。

与联合治疗相比，序贯治疗更加经济。在中国，α-干扰素较为便宜，24周的治疗大约花费3 000元，而48周的拉米夫定治疗大约花费6 000元。中国是世界上的乙肝大国，由于收入有限，大多数中国人将从廉价的治疗方案中受益。到目前为止，中国药监局已经批准了5种用于慢性乙肝治疗的药物，分别是α-干扰素、拉米夫定、阿德福韦、PEGα-2a-干扰素和恩替卡韦。这些药物在药品管理、有效期、治疗功效、耐药性和治疗成本方面都存在很大不同[4,13]。虽然恩替卡韦在不存在拉米夫定耐药突变时有很好的疗效，拉米夫定由于其价格低廉在中国仍然会被保留下来用于治疗。我们的结果表明拉米夫定和α-干扰素对于HBeAg阴性患者的序贯治疗与拉米夫定单独治疗同样有效，而且能够有效抑制YMDD突变的产生。对于慢性乙肝序贯治疗的时机和管理以及不同药物的采用仍需做进一步的研究。

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