猪囊尾蚴基质金属蛋白酶-9在猪肌肉和脑组织的表达分布*

方 文,肖靓靓,包怀恩,牟 荣

(1.贵阳医学院医学检验系,贵州贵阳 550004;2.贵阳医学院寄生虫学教研室,贵州贵阳 550004)

猪囊尾蚴基质金属蛋白酶-9在猪肌肉和脑组织的表达分布*

方 文1,肖靓靓2,包怀恩2,牟 荣2

(1.贵阳医学院医学检验系,贵州贵阳 550004;2.贵阳医学院寄生虫学教研室,贵州贵阳 550004)

应用免疫组化分析猪囊尾蚴基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。用猪带绦虫卵1 mL(8万个/mL)灌胃20 d龄健康乳猪6头,于感染后40、80、120 d分别宰杀2头猪并取含囊尾蚴的肌肉及脑组织制作4 μ m厚石蜡切片,采用Envision二步法,观察不同时期寄生在肌肉及脑组织的猪囊尾蚴基质金属蛋白酶-9的表达。结果显示,不同时期寄生在肌肉及脑组织的猪囊尾蚴均表达MMP-9,随着感染时间增加,各组织猪囊尾蚴MMP-9的表达均变化不大(P＞0.05),寄生在脑组织的猪囊尾蚴MMP-9的表达要略高于同期寄生在肌肉组织的猪囊尾蚴MMP-9的表达(P＜0.05)。感染部位组织学特征不同,猪囊尾蚴MMP-9的表达略有差异。

猪囊尾蚴;基质金属蛋白酶-9;免疫组化

金属蛋白酶(metalloproteinase,MP)是虫体活性中心依赖于金属离子的一类蛋白酶,在寄生虫中分布非常广泛,功能涉及寄生虫营养摄取、细胞分化、对宿主的入侵以及免疫逃避等许多方面,一些金属蛋白酶还具有比较强的免疫原性[1]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一组含锌的能降解细胞外基质的中性蛋白酶家族。目前认为MMP尤其是明胶酶(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)与中枢神经系统感染关系密切,通常以酶原的形式存在,一旦活化,则迅速攻击血脑屏障,降解基底膜的一些基质蛋白,破坏内皮细胞的紧密连接蛋白,促进脑水肿的形成和炎细胞的浸润,被认为是参与破坏血脑屏障的主要基质金属蛋白酶[2]。为了解猪带绦虫入侵中间宿主家猪后,脑组织寄生的猪囊尾蚴与肌肉组织寄生的猪囊尾蚴MMP-9的表达情况有何不同,进行了此项试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 20日龄三元杂交乳猪6头,体重6.5 kg～7 kg,购自贵州大学农学院动物养殖中心,经粪检和间接血凝实验(IHA)证实,无猪囊尾蚴及其他寄生虫感染。

1.1.2 主要试剂 MMP-9免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司,其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 实验虫体的来源及虫卵悬液的制备 猪带绦虫成虫,采自四川省雅江县呷拉乡猪带绦虫病患者,口服槟榔-南瓜子驱虫[3],新鲜虫体用9 g/L生理盐水浸泡保存。虫体孕节及头节用卡红染色,制作压片,经显微镜观察证实为猪带绦虫成虫。挑开猪带绦虫后段全部孕节的子宫,用生理盐水冲洗子宫数次使虫卵溢出,收集全部冲洗液,3 000 r/min离心15 min,收集沉淀的虫卵。取虫卵悬液1 mL进行胆汁孵育试验,用台盼蓝染色计数六钩蚴法[4]检测虫卵存活率为80%。取虫卵悬液0.1 mL,光镜下计数虫卵(重复操作6次,取平均值),计算虫卵总数。用生理盐水稀释虫卵悬液浓度约10万个/mL,其中的存活虫卵数约为8万/mL(10万×80%)。

1.2.2 试验动物感染 将每头猪灌胃1 mL虫卵(8万个/mL)。乳猪以专用膨化颗粒饲料饲养,隔离圈养于清洁水泥地面饲养宅内,防止自然感染。

1.2.3 免疫组化 在第40天、80天和120天各宰杀2头猪。取含猪囊尾蚴的脑组织和肌肉组织1.0×1.0×0.5 cm3各数块,置于100 mL/L福尔马林中4℃冰箱过夜。常规脱水,石蜡包埋,4 μ m连续切片。部分切片行 HE染色,部分切片经脱蜡、脱苯、水化后,置于pH 6.0枸橼酸缓冲液中用高压锅进行抗原修复2 min,PBS洗涤3次,分别滴加单克隆抗体MMP-9(1∶300),置于4℃冰箱内过夜,PBS洗涤后滴加二抗孵育30 min,然后常规DAB显色、苏木素复染、封片。阴性对照用PBS液代替一抗。

1.2.4 数据测量及显微摄影 将上述免疫组化切片每组随机选取10张,每张切片在囊尾蚴囊壁及头节随机选取5个视场,每个视场选取5个阳性表达区域用Mias图像分析处理系统测量平均光密度(平均光密度为测量薄层斑点透射光强度大小,平均光密度值越大,标本染色越浅)。光学显微摄影装置拍照。

2 结果

2.1 免疫组化观察

MMP-9阳性表达主要定位于猪囊尾蚴头节及囊壁细胞的胞浆,呈棕黄色颗粒(图1D、图1E、图1F、图1G)。不同时期寄生在脑组织及肌肉组织的猪囊尾蚴均表达MMP-9,随着感染时间增加,上述部位寄生的猪囊尾蚴MMP-9的表达均变化不大(P＞0.05),但寄生在脑组织的猪囊尾蚴MMP-9的表达略高于同期寄生在肌肉组织的猪囊尾蚴MMP-9的表达(P＜0.05)(表1)。

图1 不同时期和寄生部位猪囊尾蚴MMP-9的表达及病理观察Fig.1 Observation on the MMP-9 expression in Cysticercus cellulosae parasited in different tissues at different times on the pathological sections

表1 不同时期和寄生部位猪囊尾蚴M MP-9表达的平均光密度值Table 1 M MP-9 average value of optical density on Cysticercus cellulosae parasited in different tissues at different times

3 讨论

猪带绦虫病是在世界范围内流行、危害人类健康的肠道蠕虫病之一,而其幼虫除了可寄生于中间宿主猪外,还可寄生于人体,引起严重的囊尾蚴病[5],不仅给养殖业带来巨大经济损失,而且给人类健康带来严重威胁。

脑囊尾蚴病是一种中枢神经系统的寄生虫病,常伴随血脑屏障的破坏,导致较高的发病率和死亡率[6]。研究小鼠脑囊尾蚴病模型发现,血脑屏障和血脑脊液屏障的破坏与下列因素有关:如血管床结构特点、血源性白细胞的积累、炎性细胞因子的产生和MMP-9的异常表达等有关[7-8]。

基质金属蛋白酶(MMP)是一类分解细胞外基质的Zn2+依赖性蛋白酶家族,Ca2+存在的条件下作用更强。基质金属蛋白酶-9(又称明胶酶B)酶原相对分子质量为92 ku,活性相对分子质量83 ku,主要作用于明胶、Ⅳ、Ⅴ型胶原、弹性蛋白等[9]。Rosenberg G A等[10]免疫组化法研究显示,MMP-9定位于神经元、血管内皮细胞及胶质细胞。MMP-9合成后以酶原pro-MMP-9的形式存在。正常脑组织中只有 pro-MMP-9,而无活性的 MMP-9。内源性MMP-9来自星形胶质细胞和小胶质细胞,外源性则来自内皮细胞、渗出的中性粒细胞和巨噬细胞。MMP-9一旦激活,即可通过降解细胞外基质成分,破坏血脑屏障完整性。

本研究结果显示,不同时期寄生在脑组织及肌肉组织的猪囊尾蚴均表达MMP-9,随着感染时间增加,上述部位寄生的猪囊尾蚴MMP-9的表达均变化不大(P＞0.05),但寄生在脑组织的猪囊尾蚴MMP-9的表达略高于寄生在肌肉组织的猪囊尾蚴MMP-9的表达(P＜0.05)。推测由于MMP-9降解Ⅳ型胶原和明胶,并具有降解弹性蛋白酶的活性,可促进细胞外基质的降解,这种有效的溶组织作用促进了早期囊尾蚴在宿主体内的快速移行及随后在宿主体内的定植;此外,猪囊尾蚴虫体成分或分泌排泄抗原可刺激机体组织细胞(如血管内皮细胞表达MMP)[11],加重了机体组织损伤,使虫体到达寄生部位或异位寄生。由于大脑和肌肉的组织学特征不同,脑组织寄生的猪囊尾蚴MMP-9的表达略高于肌肉组织寄生的猪囊尾蚴MMP-9的表达。

在小鼠脑囊尾蚴病模型中,血脑屏障的破坏和白细胞从软脑膜的迁移渗出在感染几天后即可发生,而在脑实质血管部位则需要5周[12]。在感染后1 d从软脑膜血管处渗出的白细胞表达多种活性基质金属蛋白酶。这些发现表明,在感染早期渗出的白细胞需要表达多种基质金属蛋白酶,利用基质金属蛋白酶的活性穿过软脑膜血管内皮细胞之间的紧密连接复合体蛋白和血管基底膜复杂的分子结构,通常这些结构构成保护中枢神经系统的屏障。研究中分析的许多基质金属蛋白酶(如MMP-2、MMP-3、MMP-7和MMP-9)均具有降解连接复合体蛋白的作用。这些蛋白包括封闭蛋白(occluding)、水闸蛋白(claudin-5)、周膜蛋白 ZO1和 VE-钙黏素等[13]。

本研究组织病理学研究发现,感染40 d时寄生在脑组织的猪囊尾蚴周围见少量炎症细胞浸润,以淋巴细胞为主,可见个别酸性粒细胞。感染80 d时,猪囊尾蚴附近有大量炎性细胞浸润,以淋巴细胞和浆细胞为主,可见部分酸性粒细胞(图 1I)。感染120 d时,猪囊尾蚴附近同样有大量炎症细胞浸润,以不等量的淋巴细胞和浆细胞为主,可见个别多核巨细胞;部分囊壁侧可见数层嗜酸性炎症反应。感染40 d时寄生在肌肉组织的猪囊尾蚴周围以淋巴细胞,浆细胞浸润为主,有少许酸性粒细胞分布,感染80 d和120 d时,猪囊尾蚴周围有少量慢性炎症细胞浸润,以淋巴细胞为主,见少量酸性粒细胞(图1H)。推测猪囊尾蚴邻近组织浸润的多种白细胞,可表达多种活性基质金属蛋白酶,对早期猪囊尾蚴在宿主体内的快速移行及随后在宿主体内的定植起到一定的促进作用。

寄生虫感染最严重的后果之一是引起脑部并发症,而MMP在破坏血脑屏障复杂结构的过程中发挥关键作用。因此,针对一些可以导致脑部病变的寄生虫感染,或许可以选择调控MMP活性来控制疾病的进一步发展恶化。这对猪囊虫病,尤其是对人脑囊虫病防控措施的制定具有一定研究意义。

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Analysis of Expression of Matrix Metalloproteinase-9 of Cysticercus cellulosae in Porcine Mascle and Brain

FANG Wen1,XIAO Liang-liang2,BAO Huai-en2,MOU Rong2

(1.Department of Clinical Laboratory Sciences,Guiyang Medical College,Guiyang,Guizhou,550004,China;2.Department of Parasitology,Guiyang Medical College,Guiyang,Guizhou,550004,China)

To analyse the expression of matrix metalloproteinase-9(MMP-9)inCysticercuscellulosaeby immunohistochemistry methods,six piglets of 20 days old were infected with a dose of 80 000 eggs ofTaenia sodium,and the test have been done on paraffin-embedded sections ofCysticercus cellulosaeacquired at 40,80 and 120 days after infection from muscle and brain.The results showed that there were MMP-9 expressing in the head and wall ofCysticercuscellulosaefrom different tissues at different times.As the time increases,the MMP-9 expression ofCysticercuscellulosaefrom different tissues were little changed(P＞0.05),the MMP-9 expression ofCysticercuscellulosaefrom the brain were slightly higher than that from the muscle(P＜0.05).T here was a slightly differences on MMP-9 expression inCysticercus cellulosaefrom different tissues because of the different histological features.

Cysticercus cellulosae;matrix metalloproteinase-9;immunohistochemistry

S786,S852.734

A

1007-5038(2011)07-0025-04

2011-02-28

国家自然科学基金(30660168)

方 文(1968-),女,四川崇州人,副教授,博士,主要从事病原生物蛋白质组学研究。