IFN－γ对妊娠早期大鼠下丘脑中IL－18表达的影响

司丽芳，李 建，赵 瑾，陈树林，位 兰，范光丽

（1.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471003；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨陵712100；；3.上海朝翔生物技术有限公司，上海201609）

IFN－γ对妊娠早期大鼠下丘脑中IL－18表达的影响

司丽芳1，李 建1，赵 瑾3，陈树林2，位 兰1，范光丽2

（1.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471003；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨陵712100；；3.上海朝翔生物技术有限公司，上海201609）

为探讨γ干扰素（IFN－γ）对妊娠早期大鼠下丘脑中白细胞介素－18（IL－18）表达及其对妊娠结局的影响，将妊娠9d的SD大鼠随机分为对照组、试验1组和试验2组，采用生殖道肌肉注射的方法，对照组大鼠生殖道肌肉注射生理盐水，试验组大鼠注射IFN－γ，其中1组剂量为2.5×104U/只，2组剂量为7.5×104U/只。各试验组均在注射48h后灌注取材、免疫组化SP法染色，结果表明，IL－18在下丘脑视前室周核、视上核、视前大细胞核、视前内侧核、视前外侧核均具有较多数量的阳性神经元表达；阳性细胞呈圆形、卵圆形、三角形不等，阳性物质大多位于细胞质和细胞核。生殖道肌肉注射2.5×104U及7.5×104U的IFN－γ后能下调IL－18在下丘脑表达的同时会造成妊娠终止。提示IFN－γ对妊娠早期大鼠下丘脑中IL－18的表达具有调节作用，且外源注射7.5×104U IFN－γ后会造成妊娠早期大鼠流产。

下丘脑；免疫组化；妊娠大鼠；白细胞介素－18；γ干扰素

胚胎发育和着床是一个复杂而精密的过程，受诸多因素的调控。IL－18是近年来发现的细胞因子，在抗感染、变态反应性疾病发病过程中起着重要作用［1－3］，在生殖和免疫调节中也发挥着重要作用［4－5］。研究 认为，妊娠是一种特殊的Th2现象［6］，外周血循环中的细胞因子比率从Thl转化为Th2型应答，这一现象在妊娠中期达到高峰。IL－18作为一种参加机体多种免疫应答的细胞因子，在妊娠这种半同种异体移植过程中起到重要作用。IL－18可调节子宫NK细胞的产生、募集和激活，促进先天性免疫，依赖细胞因子微环境调节Th1和Th2型免疫反应。妊娠期间母体内各种因子之间相互协调，共同维持母胎之间的免疫微环境平衡。IFN－γ属于Th1型细胞因子，是妊娠必需的因子之一。研究表明超生理剂量的IFN－γ具有抗生育作用［7］。但IFN－γ和IL－18在妊娠过程中的相互关系及其外源注射IFN－γ对妊娠早期大鼠妊娠影响的研究尚未见报道。本试验应用高灵敏度的链霉素抗生物素－过氧化酶（strep taridin－peroxidase，SP）法，以妊娠D9大鼠为模型研究了外源注射2.5×104U及7.5×104U的IFN－γ对妊娠早期大鼠下丘脑中IL－18表达的影响，并通过孕鼠子宫体及其黏膜表面的变化观察了对妊娠的影响，为进一步阐明IFN－γ、IL－18在妊娠中的作用及其对妊娠的调控机制提供形态学依据。

1 材料与方法

1..1 材料

1.1.1 实验动物 体重250g左右的性成熟Spraque－Dawley雌性大鼠，购自河南省实验动物中心，饲养于清洁级动物房，自由饮水和进食，每日12 h光照，饲养1周后用于试验，用蘸有生理盐水的棉签阴道涂片法检测大鼠发情周期，发情期雌鼠阴道涂片镜检有大量的角化扁平上皮细胞，取发情期雌鼠与性成熟雄性大鼠1∶1合笼交配，次日上午8：00检查有阴栓或用蘸有生理盐水的棉签镜检有精子者为妊娠第1天（D1），大鼠根据胚胎发育的特点将妊娠分为妊娠早期（D1～D9）、妊娠中期（D10～D15）和妊娠晚期（D16～D19）三个阶段，妊娠大鼠单笼饲养。

1.1.2 试剂 重组大鼠IFN－γ，为深圳达科为公司产品，SP试剂盒，为福州迈新公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 取妊娠大鼠随机分为3组，每组6只。采取阴道口肌肉注射法，于取材前48h即妊娠的D7各试验组大鼠分别注射生理盐水（对照组）、2.5×104U IFN－γ、（试验1组）7.5×104U IFN－γ（试验2组），药物处理部位和剂量参照文献［8］。取材时进行100mL/L水合氯醛麻醉，暴露胸腔，经主动脉插管，用37℃生理盐水冲洗血液，4℃、40g/L多聚甲醛缓冲液（pH7.4）灌注固定，取出脑放入相同固定液中后固定12h～24h，再移入4℃含200 g/L蔗糖的PB液中直至组织块沉底。对下丘脑做连续冠状切片，片厚35μm，取其中3套。第1套进行免疫组化SP法染色；第2套进行Nissl染色，做核团定位；第3套用PBS代替一抗，作为对照。取脑的同时取出孕鼠子宫，仔细观察子宫黏膜表面的变化。

1.2.2 主要试剂及免疫组化SP法操作程序 免疫组化操作程序按照试剂盒说明进行，第一抗体IL－18（福州迈新公司产品）工作浓度1∶200，用DAB呈色，贴片，再用梯度酒精脱水，二甲苯透明观察。

1.2.3 统计学处理 每组切片相同核团随机选取5个不同部位，Motic数码显微镜拍照，用江苏捷达801形态分析软件对阳性细胞进行分析，计算每个视野的阳性产物染色程度均值（用平均光密度表示）和阳性面积［9］，再计算出相对表达量μ2均值：μ2＝光镜倍数×阳性强度均值×阳性面积/260 000），其中260 000为像素。试验结果用均数±标准差（±SD）表示，应用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析，采用t检验法进行统计学处理。

2 结果

经免疫组化SP染色的切片，背景无色或浅蓝色，IL－18免疫反应阳性产物为蓝色或蓝黑色，阳性细胞轮廓清楚，阳性产物位于胞质和胞核，对照组切片均为阴性，说明免疫组化SP法具有IL－18免疫反应的特异性。

2.1 IFN－γ对下丘脑视上核中IL－18免疫反应阳性神经元的分布影响

对照组大鼠下丘脑视上核中免疫反应阳性产物为蓝色或蓝黑色的强阳性着色，胞体内深蓝色颗粒融合成团，染成一片，阳性细胞轮廓清楚。阳性物质位于胞质和胞核。也有中等阳性着色的细胞，细胞轮廓清楚，蓝色颗粒呈均匀分布（图1A）。试验1组大鼠下丘脑视上核中免疫反应阳性产物多为蓝色，阳性细胞大多为弱阳性着色，细胞轮廓不清，在高倍镜下方可见到有少量浅蓝色颗粒。胞体大多呈不规则的圆形、卵圆形。阳性表达量与对照组相比显著下降（P＜0.05）（图1B）。试验2组大鼠下丘脑视上核免疫反应阳性产物中阳性细胞着色浅淡，胞质内有少量浅蓝色颗粒，阳性表达量与对照组相比差异极显著（P＜0.01），与试验1组比较差异显著（P＜0.05）（图1C）。

2.2 IFN－γ对下丘脑视前外侧核中IL－18免疫反应阳性神经元的分布影响

对照组下丘脑视前外侧核中可见大部分的细胞呈强阳性着色，阳性细胞均是胞质和胞核着色。胞体呈圆形或卵圆形，聚集或分散存在，阳性细胞内充满蓝色的反应颗粒，密集时可融合成团，呈蓝黑色。颗粒稀疏时可见圆形的蓝色颗粒（图1D）。试验1组下丘脑视前外侧核中阳性细胞多呈蓝色，均是胞质和胞核着色，胞体也多呈圆形和卵圆形且轮廓不清，其阳性细胞的表达量与对照组比较差异显著（P＜0.05）（图1E）。试验2组下丘脑视前外侧核中阳性细胞数量较少，阳性细胞呈灰色。轮廓不清，阳性细胞的表达量与对照组比较差异极显著（P＜0.01）而与试验1组比较差异显著（P＜0.05）（图1F）。

2.3 在下丘脑视前区其他核团如视前室周核、视前大细胞核、视前内侧核也有较多的阳性

神经元表达，且对照组与试验1组及试验2组相比其阳性细胞的表达量及表达强度也有一定的差异（表1）。

2.4 IFN－γ对妊娠大鼠子宫状况的影响

肉眼观察对照组大鼠子宫体黏膜外观正常，黏膜呈粉红色，黏膜表面可看到红色的网状小血管分布，子宫角内胚胎总数平均为12个，两侧子宫角内胚胎数基本相同。试验1组子宫体黏膜外观大致正常，只有个别试验鼠的子宫体黏膜上略微出现少量小点状紫褐色吸收斑，两侧子宫角内胚胎数与对照组相比也大致相同。试验2组子宫体黏膜表面均有大量紫褐色吸收斑，两侧子宫角内残留胚胎数明显减少且胚胎个体变小，子宫体外观有明显的炎症特征。

图1 IFN－γ对下丘脑视上核和视前外侧核IL－18的影响（400×）Fig.1 Effect of IFN－γon IL－18in hypothalamus nucleus supra－opticus and mucleus pre－opticus lateralis（400×）

表1 IFN－γ对妊娠早期大鼠下丘脑中IL－18表达的影响Table 1 Effect of IFN－γon the expression of IL－18in the hypothalamus of early pregnant rats

3 讨论

近年来，关于IL－18在妊娠调控中的作用受到越来越多的重视［10］。IL－18是 Okamura H 等［11］于1995年从内毒素休克小鼠肝细胞中克隆出的分子质量为18ku～19ku的物质，有多种生物活性，其表达异常将会引发疾病产生。IL－18还可参与调控Th1/Th2的平衡。有报道表明［12］，若下丘脑中IL－18水平降低，其对垂体的内分泌调节功能将会减弱，并最终影响妊娠期间子宫功能的发挥，对胚胎存活不利。本试验发现，外源性的高剂量的IFN－γ可以下调下丘脑视前区与妊娠有关的一些核团，如视前室周核、视上核、视前大细胞核、视前内侧核、视前外侧核等部位IL－18免疫反应阳性神经元的表达，表明IL－18通过参与调节妊娠期间下丘脑的神经内分泌活动，对妊娠调控发挥着重要作用，IL－18对妊娠的调控与IFN－γ有着非常密切的关系。IFN－γ是妊娠必需的细胞因子之一，主要由NK细胞分泌［13］，对保持蜕膜细胞的完整性及“着床”窗口的打开方面发挥着重要作用［14］，但妊娠期间子宫蜕膜的过高表达对妊娠是不利的，有研究报道［15－16］，IFN－γ能抑制孕酮分泌，诱导胎盘细胞凋亡，还能诱导胎盘MHCⅡ类抗原的表达。IL－18和IFN－γ都是妊娠期维持免疫微环境的细胞因子网络成员，从免疫反应上来说，二者起颉颃作用，IL－18抑制免疫应答，而IFN－γ促进免疫应答。本试验的结果表明，生殖道肌肉注射2.5×104U及7.5×104U的IFN－γ后会下调妊娠早期大鼠下丘脑视前区与妊娠有关的一些核团中IL－18的表达。且注射7.5×104U的IFN－γ后可明显导致早期妊娠大鼠流产，而外源注射2.5×104U的IFN－γ后对妊娠的影响较小。推测外源注射7.5×104U的IFN－γ后会影响IL－18在妊娠期间下丘脑的水平，并最终导致IL－18对垂体的内分泌调节功能减弱，从而影响了妊娠期间子宫功能的发挥而导致流产，提示IFN－γ和IL－18在细胞因子网络中有相互颉颃、制约的作用，但在正常妊娠过程中可能会与其他细胞因子成员相互协调共同维持妊娠的正常进行。

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Effection of IFN－γon IL－18 Expression in Hypothalamus of Pregnant Rat

SI LI－Fang1，LI Jian1，ZHAO Jin3，CHEN Shu－lin2，WEI Lan1，FAN Guang－Li2

（1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang，Henna，471003，China；
2.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA＆FUniversity，Yangling，Shaanxi，712100，China；
3.ShanghaiZhaoxiangBiotechnologyCo.，Ltd.Shanghai，201609，China）

In order to investigate the effect ofγ－interferon（IFN－γ）on the expression of interleukin－18（IL－18）in the hypothalamus and pregnant result of pregnant rat，earlier pregnant rat（D9），were divided into control group，experiment group 1and experiment group 2.The rats in control group were injected with physiological brine，and the rats in other two groups were injected with 2.5×104IU IFN－γand 7.5×104IU IFN－γrespectively in muscle of vagina.The perfusions of each group were collected 48hafter injection.Hypothalamus of rats in each group was collected and stained by immunohistochemical SP method.The result showed as follows：there were many IL－18positive expression in nucleus pre－opticus medianus，nuclens supra－opticus，nuckeus pre－opticus mango cellularis，nucleus pre－optius medialis and nucleus pre－opticus lateralis in the hypothalamus.The positive neurons were in round，oval round and triangle.And the positive neurons were mainly distributed in plasma and nucleus.The injection of 2.5×104IU and 7.5×104IU IFN－γby vaginal muscle could reduce the expression of IL－18and stop pregnant.The results suggested that the IFN－γhas regulatory effect on the expression of IL－18in the hypothalamus，IL－18on pregnancy and the regulation of IFN－γhas a very close relationship.

hypothalamus；immunohitochemistry；pregnant rat；interleukin－18；γ－interferon

S852.21

A

1007－5038（2011）10－0040－04

2011－04－07

国家自然科学基金资助项目（30972151）；教育部研究生科技创新基金（05ych020）；河南科技大学博士研究生科研启动基金（09001543）

司丽芳（1976－），女，河南夏邑人，讲师，博士，主要从事神经生物学研究。