感染A型产气荚膜梭菌小鼠体内α毒素的分布及定位

王苗利，蔡玉梅，柴同杰，张红娜

（山东农业大学动物科技学院环境微生物实验室，山东泰安271000）

感染A型产气荚膜梭菌小鼠体内α毒素的分布及定位

王苗利，蔡玉梅＊，柴同杰＊，张红娜

（山东农业大学动物科技学院环境微生物实验室，山东泰安271000）

为了研究α毒素在感染A型产气荚膜梭菌动物的体内的分布情况，自制了高效价的兔抗α毒素多克隆抗体作为一抗，HRP和FITC分别标记的羊抗兔IgG作为二抗，通过免疫组化法对α毒素进行了定位检测。结果表明，在小鼠延髓、肠、肾、肺、胃的间充质细胞胞浆中发现了阳性颗粒，在脾、肝的间充质细胞中未发现毒素分布。结果提示，首次在延髓的细胞胞浆中发现了α毒素，表明α毒素能突破血脑屏障进入延髓损坏生命中枢，这可能是引起动物死亡的一个重要原因。

A型产气荚膜梭菌；α毒素；蛋白表达；免疫组化

＊通讯作者

产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）又称魏氏梭菌，是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症和人创伤性气性坏疽的主要病原菌之一［1］。该菌分为A、B、C、D、E 5个型，其致病因子是菌体产生的外毒素［2］。在家畜，主要引起牛羊“猝死症”［3］。在家禽，主要引起坏死性肠炎而危害养禽业［4］。其中A型产气荚膜梭菌病是影响养殖业的主要疾病之一，给养殖业带来了巨大的经济损失。此外，A型产气荚膜梭菌还可引起人的食物中毒［5］。该型菌的主要致病毒素是α毒素，它具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性［6］。

国内外对产气荚膜梭菌α毒素的致病性进行了许多方面的研究［7］，但缺少具体的有关检测A型产气荚膜梭菌α毒素在患病动物体内各组织中的分布情况的研究。本试验以小鼠为试验动物，采用免疫组化方法探讨α毒素在小鼠体内的分布，方法简便，操作简单，周期短，便于保存，可为进一步阐明α毒素致病机理提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

产气荚膜梭菌A528型菌株（ATCC528标准菌株，由德国柏林大学提供），本实验室保存；新西兰兔（2.5kg）及昆明小鼠（18g～20g），购自泰邦生物公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；限制性内切酶、DNA凝胶回收试剂盒和克隆载体、表达载体pET28a为宝生物工程（大连）有限公司产品；感受态细胞Top10、BL21（DE3）PlysS及其DNA抽提试剂为北京全式金生物技术有限公司产品；Ni－Agarose His标签蛋白纯化柱、抗体亲和层析纯化柱及T－MaxTM佐剂为南京金斯瑞生物科技有限公司产品；HRP标记羊抗兔二抗、FITC标记羊抗兔二抗、过氧化物酶DAB底物显色液为北京博奥森生物公司产品。

1.2 方法

1.2.1 α毒素全基因的PCR扩增、克隆及表达载体的构建 通过引物软件DNA Star以及primmer5.0，设 计 上 游 引 物 5′－GCGGAATTCATGAAAAGAAAGATTTGT－3′，下游引物 5′－GCGGCGAAGCTTTTATTTTATATTATAAGTT－3′，预期产物长度1 228bp。回收PCR产物，与T载体连接、转化，蓝白斑筛选阳性重组菌。将重组质粒与表达载体pET28a用EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切，回收片段和线性pET28a，将两者连接、转化，筛选阳性重组菌落，接种于含100mg/mL Kan的LB培养液中扩增，提取质粒，送金斯特工程有限公司测序。

1.2.2 α毒素蛋白的诱导表达与纯化 将重组菌液接种到LB培养基中，分为4组，37℃振荡培养，IPTG终浓度分别为0 、0.1、0.6、1.0mmol/L，将不同时间的菌液取样，SDS－PAGE电泳分析，同时做空载体对照组，根据电泳结果判定最佳诱导条件。将最佳条件下表达的菌液超声裂解，4℃离心，分离上清与沉淀。沉淀用尿素重悬，与上清分别上柱纯化，透析。

1.2.3 制备兔抗α毒素多克隆抗体 将透析后蛋白与佐剂混合制成疫苗免疫兔，同时设对照组，14d后第2次免疫，28d后第3次免疫，35d后采血ELISA测滴度，38d后颈部采血，经亲和层析柱纯化去除杂抗体，测定效价。

1.2.4 A型产气荚膜梭菌攻毒试验 将A528菌株接种于Gordon产毒肉汤，42℃厌氧震荡培养6h～9h，取培养液常规硫酸铵沉淀法提取外毒素，用灭菌生理盐水稀释，腹腔皮下注射于6只小鼠，同时设生理盐水注射阴性对照组，取72h内死亡小鼠的组织，投入40g/L多聚甲醛固定液中，阴性对照组操作同上。

1.2.5 组织切片的制备及病理组织学检查 组织于多聚甲醛中固定48h后，常规脱水、透明、包埋、切片。取对照组和攻毒组的切片做常规HE染色，观察病理组织学变化。操作步骤如下：切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，水化，置入Gill苏木素中染色10min，水冲至不脱色。盐酸酒精溶液分化、返蓝。取出切片置于850mL/L酒精溶液2s，再置于10g/L伊红染液染色0.5min～1min，水冲至不脱色为止。取出切片进行酒精脱水，二甲苯透明，封片、镜检。

1.2.6 α毒素蛋白的免疫组织化学检测 取攻毒组的组织切片，分别进行酶标及荧光标记免疫组化实验。将兔抗α毒素一抗稀释倍数依次设为1∶50、1∶100、1∶300，1∶600、1∶1 000，HRP标记二抗稀释倍数为1∶100、1∶200，FITC标记二抗稀释倍数为1∶100、1∶200。同时设阴性对照，阴性对照使用未攻毒小鼠组织，摸索一抗、二抗的最佳稀释倍数。步骤如下：将各组织切片于57℃烤箱内烘烤4 h后，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，水化；取出切片于3mL/L过氧甲醇中室温孵育20min，再用PBS漂洗2min×3次，置于0.5mL/L Teween－20中室温孵育3min～5min；将切片浸于柠檬酸盐缓冲液中，进行微波修复，每次修复5min，共修复3次，中间室温冷却，冷却后PBS漂洗2min×3次；滴加50g/L BSA封闭液，于37℃湿盒内孵育20min；弃去孵化液，滴加1∶300稀释浓度的兔抗α毒素抗体，4℃湿盒内孵育14h～18h后，取出湿盒于37℃复温45 min，PBS漂洗2min×3次；切片置0.5mL/L Teween－20中室温孵育2min，弃去多余液体，滴加浓度为1∶200的HRP标记的山羊抗兔IgG，37℃湿盒孵育40min，用PBS漂洗2min×3次；滴加辣根过氧化物酶DAB显色液至标本上，显色5min～10min，蒸馏水充分洗涤终止反应；切片置入Gill苏木素中染色1min，脱水，透明封片，镜检。

FITC荧光标记免疫组化操作方法同免疫组织化学检测，只是在HRP标记的山羊抗兔IgG，37℃湿盒孵育40min后，PBS漂洗2min×3次后，即可封片于荧光显微镜下进行镜检。

2 结果

2.1 α毒素全基因PCR扩增、克隆及表达载体的构建结果

在进行了32个循环的扩增后，经10g/L琼脂糖凝胶电泳，结果表明，成功扩增出1 228bp的α毒素基因片段（图1）。

图1 PCR结果电泳图Fig.1 Electrphoresis of PCR products

阳性重组质粒经EcoRⅠ/HindⅢ双酶切后能被切成约1.2kb和5kb的2个片段，与预期的酶切图谱相一致（图2）。

图2 重组表达质粒双酶切产物电泳图Fig.2 Electrophoresis of restriction enzyme digestion products of recombinant expression plasmid

2.2 α毒素蛋白的诱导表达与纯化结果

取不同IPTG浓度、不同诱导时间的样品进行SDS－PAGE电泳（图3），结果表明，IPTG浓度为0.1 mmol/L时诱导6h表达量最高；选取此条件下诱导的菌液超声裂解，上清及沉淀样品分别上样纯化，经SDS－PAGE电泳，考马斯亮蓝染色及脱色液脱色（图4），说明目标蛋白主要以包涵体的形式存在。

图3 不同IPTG浓度不同时间样品SDS－PAGE电泳图Fig.3 SDS－PAGE of samples with different IPTG concentrations and induction time

2.3 兔抗α毒素多克隆抗体ELISA结果

抗体经纯化后进行ELISA效价测定，结果表明，抗体效价达1∶512 000以上，说明表达的α毒素蛋白免疫原性强，免疫程序合理，符合免疫组化检测的要求。

2.4 患病小鼠病理组织学检查结果

图4 Ni－NTA柱提纯后蛋白SDS－PAGE电泳Fig.4 SDS－PAGE electrophoresis figure of protein purified by Ni－NTA column

经最佳稀释度摸索实验后，最终确定一抗最佳稀释倍数为1∶300，HRP标记二抗稀释倍数为1∶200，FITC标记二抗稀释倍数为1∶100。A528产气荚膜梭菌外毒素致死小鼠的病理变化主要以出血性变化为主，天然孔出血，组织广泛性出血，胃黏膜出血、部分脱落，小肠出血、肠黏膜脱落。延髓脑膜充血、出血；肺严重的出血，肺泡破裂，肺泡壁增厚、间质增宽，间质内可见大量红细胞浸润，小动脉及肺泡壁毛细血管扩张充血；肾脏充血、肿胀，肾小管之间有散在的红细胞，肾小球毛细血管扩张充血，肾间质增生、出血；胃黏膜层部分脱落，胃壁变薄；小肠黏膜层脱落，黏膜层和黏膜下层出血；心脏肌纤维束间出血、充血；肝脏淤血、肿胀、可见有坏死灶；肝组织充血、血管扩张严重充血、肝细胞显著肿大；脾脏淤血、肿胀，红髓区显著充血、出血，脾小梁变性坏死（图5A～图5D）。阴性对照组则无上述病变（图5E～图5H）。

图5 部分组织病理切片图Fig.5 Histopathological section of Part organic

2.5 患病小鼠免疫组织化学检查结果

在延髓、胃肠黏膜、肾脏及肺泡上皮的主质细胞的胞浆中发现了阳性颗粒，在脾、心、肝的主质细胞中未发现毒素分布（图6A～图6C，图7A～图7C），阴性对照组则无阳性细胞（图6D～图6F，图7D～图7F）。

图6 部分组织HRP标记免疫组化结果图（1 000×）Fig.6 The resrults of immunohistochemistry marked with HRP of part organs（1 000×）

图7 部分组织FITC标记免疫组化结果图（1 000×）Fig.7 The resrults of immunohistochemistry marked with FITC of part organs（1 000×）

3 讨论

本试验利用自制高效价兔抗α毒素多克隆抗体对攻毒小鼠进行α毒素定位，结果表明，粗制外毒素攻毒死亡的小鼠呈全身出血性变化，胃黏膜和肠黏膜脱落、出血，肾、肝、脾、心脏、肺、脑、泄殖腔的充血、出血；经免疫组织化学检测后，发现毒素主要定位在肺、肾、胃、小肠、延髓间充质细胞的细胞质内，在肝、脾的间充质细胞内没有发现阳性颗粒。根据HE染色及免疫组化检测结果，推测A型产气荚膜梭菌ɑ毒素的致死的原因如下：细菌在动物体内大量繁殖，产生毒素，毒素随血液循环系统到达全身，因α毒素具有磷脂酶C和鞘磷脂酶的活性，破坏细胞膜结构的完整性［8－13］，所以在攻毒致死小鼠的心、肝、脑、脾、肺、肾、小肠、胃等组织器官中发现出血、充血、坏死等病变，并在肺、肾、胃、小肠、延髓间充质细胞的细胞质内发现了免疫阳性颗粒。而进入肝脏门静脉的血液由于之前已流经脾脏，经过脾脏的吞噬作用后，进入肝脏的ɑ毒素量已经大量减少，又经肝脏自身的解毒作用，因此在肝脏的间充质细胞内没有发现ɑ毒素的存在。ɑ毒素突破了血脑屏障的防御作用，侵害延髓的神经元细胞质，影响心脏、肺的自主神经活动。控制动物心跳、呼吸的生理功能中枢正是位于延髓，因此，延髓一旦受到破坏，心、肺等器官不能正常工作，动物的生命就会发生危险。

本试验已证实，产气荚膜梭菌ɑ毒素能破坏肺、肾、胃、肠等间充质细胞的细胞膜进入细胞质内，损害脏器功能，但关键的因素很可能是ɑ毒素能突破血脑屏障，侵害延髓的生命中枢，破坏呼吸系统及心脏的传导系统，从而导致"猝死症"的发生。本试验对A型产气荚膜梭菌的ɑ毒素进行了定位，有关其他型产气荚膜梭菌的ɑ毒素及其他毒素在患病动物体内分布情况的研究也具有重要的意义，有待于进一步的研究。

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Distribution and Localization of Aalpha Toxin in Mice Infected WithClostridiumperfringensType A

WANG Miao－li，CAI Yu－mei，CHAI Tong－jie，ZHANG Hong－na
（CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShandongAgriculturalUniversity，Tai＇an，Shandong，271017，China）

In order to test the distribution of alpha－toxin in animals infected byClostridiumperfringenstype A，the high titer rabbit anti－alpha－toxin polyclonal antibodies prepared as primary antibodies and HRP or FITC conjugated secondary antibodies were used to detect the alpha－toxin by immunohistochemistry method.Results showed that positive particles were located in the main qualitative cell plasma of medulla，intestine，kidney，lungs and stomach except liver and spleen.The result indicated that the alpha－toxin was firstly found in cell plasma of medulla which broke through the blood brain barrier to damage the vital center.It may be an important reason why the alpha－toxin could cause animal death.

Clostridiumperfringens；α－toxin；protein expression；immunohistochemistry

S852.616.3

A

1007－5038（2011）10－00019－05

2011－04－12

山东农业大学青年科技创新基金（23655）；中国国际合作项目“动物疫源性人畜共患病的监测”（2009DFA32890）

王苗利（1987－），女，山东泰安人，硕士研究生，主要从事产气荚膜梭菌致病性的研究。