神经生长因子对大鼠脑缺血再灌注后Fas-L蛋白和p-PKB表达的影响

王洪津，白艳娟,辛世萌

(大连医科大学 附属第二医院，神经内科，辽宁 大连 116000)

缺血性脑血管病是临床常见病、多发病，而脑缺血再灌注损伤是治疗缺血性脑血管病的一大难题。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是重要的生物活性因子之一，对神经细胞的生长发育、分化、再生发挥调节作用，是参与损伤神经再生和功能恢复的重要因素，NGF可用于治疗脑细胞损伤和各种神经损伤[1]。本实验利用经典的MCAO模型，以免疫组化方法观察脑缺血2 h再灌注不同时间点脑组织内促凋亡因子Fas-L及抗凋亡因子p-PKB的表达，并观察NGF对其表达的影响，探讨NGF的神经保护作用，为临床应用NGF治疗脑梗塞提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康成年SD大鼠55只(大连医科大学动物实验中心提供)，雌雄不限，体重200～250 g，清洁级，饲养环境温度21°C，自由进食水。

1.2 试剂和药品

p-PKB兔抗体、Fas-L兔抗体，免疫组化SABC试剂盒，DAB显色液，注射用NGF(购于博士德试剂公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组：随机分为假手术组(n=5)(第1组)；对照组(n=30)，按缺血2 h再灌注2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h再分为6组(分别为2、3、4、5、6、7组)，每组5只；NGF(第8f组和8p组，分别为缺血2 h再灌注6 h和再灌注72 h注射NGF，每组5只)和生理盐水对照组(第9f组和9p组，分别为再灌注6 h和再灌注72 h注射生理盐水，每组5只)。

1.3.2 脑缺血再灌注模型制备(MCAO模型)：均采用线栓法行右侧大脑中动脉局部脑缺血-再灌注模型。缺血2 h，再灌注时间点按分组要求。假手术组插入鱼线后马上抽出，余步骤同手术组。

1.3.3 NGF给药方法：第8组大鼠于再灌注后5 min肌肉注射NGF(每100 g体重NGF500BU/0.1 mL)，第9组以同样方法注入相同体积的无菌生理盐水。

1.3.4 神经功能缺损评分：按Zea Long 5分制标准评分：0分，无神经缺损症状；1分，不能伸展对侧前爪；2分，行走时向偏瘫侧转圈；3分，向偏瘫侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。0分和4分者剔除。

1.3.5 免疫组织化学检测法：标本及切片制备：各组大鼠在各自再灌注时间点后经心脏灌注内固定，断头取脑，4%多聚甲醛外固定24 h，自视交叉处开始向后做冠状切片，石蜡包埋，连续切片4 μm,严格按试剂盒说明行Fas-L和p-PKB免疫组织化学染色。每张切片显微镜下分别随机选取缺血区内的4个视野，进行p-PKB阳性细胞和Fas-L阳性细胞计数。判断标准：显微镜下观察并计数阳性细胞数，镜下胞质或胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，无棕黄色颗粒者为阴性结果。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 神经功能缺损评分

假手术组无神经功能缺失，缺血再灌注组神经功能评分见表1。其中，NGF组(8组)与生理盐水(9组)比较，神经功能均明显减轻(P<0.01)。

表1 各组神经功能缺损评分

2.2 Fas-L蛋白的表达

假手术组大鼠有少量Fas-L蛋白表达(图1)，主要分布于皮质及海马，缺血再灌注组Fas-L蛋白表达明显增多，光镜下胞浆呈棕黄色，染色较深，散在分布，尤以6 h组增多明显(图2)，24 h后逐渐下降，NGF组Fas-L蛋白表达较生理盐水组明显下降，染色较淡(图3与图4对比)。具体见表2。

2.3 p-PKB的表达

假手术组大鼠有少量p-PKB蛋白表达(图5)，主要分布于皮质及海马，缺血再灌注组p-PKB蛋白表达明显增多，光镜下胞浆呈棕黄色，染色较深，散在分布，尤以72 h组增多明显(图6)， NGF组p-PKB蛋白表达较生理盐水组明显增加，染色较深(图7与图8比较)。具体见表3。

表2 各组Fas-L蛋白表达

表3 各组p-PKB蛋白表达

图1 假手术组

图2 6 h组

图3 生理盐水组

图4 NGF组

图5 假手术组

图6 72 h组

图7 生理盐水组

图8 NGF组

3 讨 论

3.1 Fas-L凋亡基因

Fas-L(Fas配基)是调控细胞凋亡的基因之一,属于肿瘤坏死因子受体家族[2]，是一种促凋亡蛋白。在缺血脑组织内，Fas-L表达增多，通过以Fas/Fas-L系统为代表的凋亡信号转导途径将凋亡信号传递到细胞内，促使细胞凋亡[3]。Fas-L蛋白复合三聚体具有诱导凋亡的能力，并通过死亡域间的相互作用促进Fas-L蛋白聚合而传导死亡信号，激活转录因子NF-κB，启动靶细胞内的凋亡程序。实验显示Fas-L蛋白表达增多时，凋亡明显可见，干预治疗后Fas-L蛋白表达减少，说明Fas-L与凋亡密切相关。本研究表明Fas-L蛋白在正常新生大鼠脑内弱表达，缺氧缺血后病变部位出现散在分布的强阳性细胞，多是凋亡脑细胞，提示Fas-L与脑细胞凋亡有直接的关系，Fas-L参与了脑细胞凋亡的过程。具体的说，本实验中大白鼠缺血2 h再灌注2 h后Fas蛋白表达增加，再灌注6 h Fas蛋白表达达高峰，再灌注24 h后表达与6 h相比明显减弱(P<0.01)，与文献报道一致，说明脑缺血再灌注后存在Fas介导的细胞凋亡。

3.2 p-PKB蛋白

p-PKB(磷酸化蛋白激酶B)，是一种在很多生物反应中起重要作用的丝氨酸蛋白激酶。脑缺血时，PI3-K(3磷脂酰肌醇激酶)/PKB通路激活，可减少细胞的凋亡[4，5]。PKB为分子量大约为60 kD的蛋白激酶，是PI3-K/PKB通路中PI3-K直接的下游作用靶点，该通路激活时PI3-K可以磷酸化PKB苏氨酸308(Thr-308)和丝氨酸473(Ser-473)位点的氨基酸残基，从而激活PKB转换成其活化形式(p-PKB),而p-PKB对脑缺血后海马CA1区神经元有保护作用。

3.3 NGF的神经保护作用及机制

NGF是神经系统重要的生物活性分子之一[6]。它最初是从小鼠的颌下腺提取的,其分子量140000 kD左右,有3个亚单位组成(α、β、γ),广泛分布于神经元的胞体、胞质和突起[7]。NGF作为中枢神经系统中最重要的生物活性物质,有保护神经元,对抗缺氧、兴奋性氨基酸、自由基和低血糖、细胞内钙超载及一氧化氮损伤的作用[8]。在神经损伤后，NGF重新表达，保护受损的神经，对神经细胞的发育、成熟、存活都有重要作用，主要可能与以下机制有关[9]：(1) NGF可提高氧自由基清除剂的活力,增加过氧化氢酶，超氧化物歧化酶，谷胱甘肽过氧化氢酶的活性，从而减少NO的产生量,抑制fas-L蛋白的表达,对减轻神经元损伤有重要作用[10]；(2)NGF影响细胞膜上离子泵,如Na+，K+-ATPase 的活性,稳定细胞内Na+/K+浓度比,拮抗兴奋性氨基酸的神经毒性；(3)稳定细胞内钙浓度；(4)有实验证明,NGF可以通过促进Bcl-2、HSP70的表达,抑制c-fos、c-jun、P53蛋白的表达,抑制caspase-3、ERK-1的表达[11-14],从而起到抑制神经细胞凋亡的作用。

近年的研究表明，在脑毛细血管内皮细胞上富含一些特殊蛋白质，可转运一些特殊蛋白质分子。而且，血脑屏障本身还存在固有的薄弱环节。再者，脑缺血时血脑屏障可能有一定程度的破坏。故本实验选择肌肉注射NGF。结果表明，NGF注射组的大鼠神经功能评分显著降低，Fas-L蛋白表达明显减少，p-PKB蛋白表达明显增多，说明肌肉注射NGF有明显的保护作用。

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