进展期胃癌P53蛋白和PCNA/cyclin的表达

赵鲁笳，邢广莹，王美华，刘天卿

(大连市友谊医院 病理科，辽宁 大连 116001)

抑癌基因P53定位于人类染色体17P13，其等位基因的缺失和突变在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用。增殖细胞核抗原/细胞周期蛋白(PCNA/cyclin)是一种在细胞G1后期和S早期广泛表达的核蛋白，它是检测肿瘤细胞增殖活性的常用指标。本研究旨在探讨P53及PCNA表达与肿瘤分化程度的关系，评价其在胃癌诊断及判断生物学行为和预后中的意义。

1 材料和方法

1.1 研究材料

大连市友谊医院1994年1月～1999年12月的进展期胃癌65例。其中，高分化腺癌14例，中分化腺癌20例，低分化腺癌31例。另收集正常胃黏膜5例。患者男 52例，女13例，平均年龄60.4岁。标本经10%甲醛固定，常规脱水浸蜡包埋，连续切片。切片厚4～6μm。试剂: P53(PAb1801),PCNA(PC10),生物素化IgG,LSAB kit均为Dako公司产品。

1.2 方 法

切片常规脱蜡至蒸馏水后 P53行柠檬酸—微波—LSAB综合技术法免疫组化染色；PCNA行常规LSAB法免疫组化染色，同时用已知阳性切片和TBS替代第一抗体分别作阳性及阴性对照，用Harris苏木素液复染。

1.3 判断标准

进展期胃癌分化程度根据传统病理形态学分为高分化、中分化、低分化Ⅲ级；P53阳性细胞半定量分级参照Galand分级法[1]，整张切片或病变区无着色为0级，阳性细胞数<10%为Ⅰ级，10%～50%为Ⅱ级，>50%为Ⅲ级；PCNA阳性细胞半定量分级参照 Jain′s分级标准[2]，观察5个具有代表性的高倍视野，按阳性细胞所占比例分为Ⅳ级，即1%～25%为Ⅰ级，26%～50%为Ⅱ级，51%～75%为Ⅲ级，76%～100%为Ⅳ级。其中，Ⅰ、Ⅱ级为弱阳性，Ⅲ、Ⅳ级为强阳性。

1.4 统计学方法

所有标本均由两名医师采用双盲法观察切片，所得统计学资料行χ2检验,P<0.05为差异有显著性意义。

2 结 果

2.1 正常胃黏膜P53与PCNA的表达

P53和PCNA阳性表达均定位于细胞核，呈黄棕色，为颗粒型或弥漫型。正常胃黏膜P53蛋白不表达，为阴性。PCNA主要表达在胃腺中下部的细胞增殖带，黏膜表面上皮细胞为阴性，黏膜固有层内淋巴滤泡生发中心细胞多为阳性。

2.2 胃癌中P53蛋白与PCNA的表达

进展期胃癌标本65例中有35例(53.85%)有P53蛋白的表达。其中，18例P53蛋白呈过度表达，占阳性标本的51.43%，主要表达在分化较差的肿瘤细胞增殖区，P53染色定位于细胞核，分布呈异质性(图1、2)。65例胃癌大部分均有明显的PCNA表达，Ⅰ级1例(1.54%)，Ⅱ级7例(10.77%)，Ⅲ级24例(36.92%)，Ⅳ级33例(50.77%)。癌中PCNA阳性细胞成簇出现(图3、4)。癌旁黏膜不典型增生PCNA呈不同程度的表达,部分癌巢周围间质中浸润的淋巴细胞、增殖的纤维母细胞也呈PCNA阳性表达。

2.3 P53蛋白和PCNA表达强度与癌组织分化程度的关系

高分化癌14例，P53阳性率为42.86%，中分化癌20例，P53阳性率为55.00%，低分化癌为31例，P53阳性率为58.06%。胃癌的分化程度与 P53阳性率之间差异无显著性意义(P>0.05)，但是P53阳性表达率随着癌分化程度的降低而逐渐增强(分别为21.43%、25.00%、32.26%)，见表1。大部分癌组织(87.69%)均有PCNA的过度表达，胃癌的分化程度与PCNA阳性率之间差异有显著性意义(P<0.05)，随着癌分化程度的降低PCNA阳性表达强度逐渐进一步增强，见表2。

2.4 癌组织中 P53蛋白和PCNA表达的比较

进展期胃癌65例中,P53和PCNA均阳性35例；P53阴性但PCNA阳性30例；PCNAⅠ～Ⅱ级8例，P53阳性3例，阴性5例；PCNA Ⅲ级24例，P53阳性14例，阴性10例；PCNA Ⅳ级33例，P53阳性20例，阴性13例。随着胃癌恶性程度的增高，P53、PCNA的表达强度均随着相应增高，两者呈平行关系。

3 讨 论

肿瘤抑制基因 P53在肿瘤的发生、发展中起着重要作用。目前的研究表明，50%以上的人类肿瘤有P53基因突变。基因产物为 P53蛋白，由393个氨基酸组成，能与特异的DNA序列结合并且激活转录[3]。点突变是P53基因失活的一种方式，正常情况下，细胞内野生型P53的表达水平很低，用一般的免疫组化方法很难检测到，只有当 P53基因发生突变时，其蛋白产物才高度表达。因此，一般认为，用免疫组化方法检测出 P53阳性表达即表示有 P53基因突变的发生。本研究应用柠檬酸—微波—LSAB法免疫组化技术对65例进展期胃癌标本进行 P53标记，结果显示P53的阳性检出率为53.85%。其中，18例有 P53蛋白的过度表达，而且P53表达强度随着癌分化程度的降低而逐渐增强。虽然，各级癌组织 P53阳性率差异无显著性意义(P>0.05)，但作者认为 P53表达强度与癌组织分化程度有其内在联系。Nigro 等[4]认为P53突变发生与肿瘤的形成过程中，其突变产物可能通过与野生型产物结合产生优势阴性效应(dominant negative effect)从而使 P53功能失活。当野生型等位基因更进一步丢失时，只剩下突变的等位基因，肿瘤细胞表现为排列紊乱，极性消失，增殖旺盛，速率加快，恶性程度增高，使其更具浸润性及转移性。本研究结果也支持这种假设。本研究在65例进展期胃癌中发现有18例呈 P53的过度表达，而且大部分为中、低分化癌(>83.33%)，说明P53 基因突变不仅发生于肿瘤的形成阶段而且主要发生在肿瘤细胞的发展阶段即进展期。本文结果提示，随着肿瘤细胞生物学活性的增强,P53基因突变及产物 P53蛋白的积聚和表达也稳定增加并始终贯穿于胃癌发生、发展的整个演进过程。

图1 胃中分化管状腺癌，P53表达阳性 LSAB法200×

图2 胃低分化腺癌,P53表达强阳性 LSAB法200×

图3 胃中分化管状腺癌,PCNA表达阳性 LSAB法200×

图4 胃低分化腺癌，PCNA表达强阳性 LSAB法400×

表1 P53蛋白表达强度与胃癌分化程度的关系

表2 PCNA表达强度与胃癌分化程度的关系

增殖细胞核抗原(PCNA/cyclin)是原位检测肿瘤细胞增殖活性的免疫标记物，许多研究证明PCNA合成和表达与细胞增殖状态相关[5]。关于肿瘤生长速度与分化程度及转移的关系，目前亦有不同观点。有研究者认为，PCNA阳性细胞的多少能反映肿瘤生长速度及恶性程度，预示肿瘤转移危险及患者的存活时间[6，7]；相反的观点认为肿瘤生长速度仅反映当前阶段肿瘤发展的状态，仅与肿瘤细胞动力学有关，而与肿瘤组织的分化程度无必然联系[8]。本研究中，PCNA在正常胃黏膜表达弱而规律，仅限于胃腺中下部的细胞增殖带范围，在胃癌中PCNA表达的阳性细胞数明显增多。作者常观察到灶状的阳性细胞密集区，过度表达的阳性细胞数>80%，PCNA表达在高、中分化癌中有一定的分布规律，而低分化癌内PCNA阳性细胞则呈弥漫性无规律分布。分布呈异质性，说明其增殖活跃并与正常组织相差甚远，提示癌细胞生长失控， DNA合成紊乱，同时反映肿瘤增殖细胞群中并非所有细胞均同步增殖。在癌间质中部分浸润的淋巴细胞及增生的纤维母细胞表现为PCNA阳性，说明癌细胞除了自分泌肿瘤生长因子引起自身增殖外，还可以通过旁分泌作用刺激周围细胞增殖[9]。

本研究结果显示，PCNA阳性分级与胃癌分化程度差异有显著性意义(P<0.05)。癌组织分化程度越低，PCNA表达的阳性细胞数就越多，表达强度越强，反映出肿瘤细胞增殖活性和分化程度的一般规律。本组中 P53的阳性表达程度与PCNA的表达呈平行关系，并有明确的量的概念，更能反映出肿瘤细胞的增殖活性与分化程度的关系，说明癌细胞增殖旺盛，增殖速率加快，P53和PCNA的过度表达增加了肿瘤恶性转化的危险性。因此，采用原位检测进展期胃癌中P53蛋白和PCNA的表达，比传统依据病理形态学和分化程度来判断肿瘤细胞生物学活性和恶性程度更为客观、可靠，且简便易行，对判断预后指导治疗有一定意义。

参考文献:

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[3] Pietenpol JA,Tokino T,Thiagalingam S,et al.Sequence-specifie transcriptional activation is essential of growth Suppression by P53[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994，91(6):1998-2002.

[4] Nigro JM,Baker SJ,Presinger AC,et al.Mutations in the P53 gene occur in diverse human tumours type[J].Nature,1989,342(6250):705-708.

[5] Woods A,Hanby AM,Hall PA,et al.The prognostic value of PCNA(proliferating cell nuclear antigen) immunostaining ingastro-intestinal lymphomas[J].J Pathol,1990,161(4):342-345.

[6] Lee KE,Lee HJ,kim YH,et al.Prognostic significance of P53,nm23,PCNA and c-erbB-2 in gastric cancer[J].Jpn J Clin Oncol,2003,33(4):173-179.

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[8] Koretz K,Schlag P,Moller P.Expression of epidermal growth factor receptor in normal colorectal mucosa,adenoma and carcinoma[J].Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol,1990,416(4):343-349.

[9] Bravo R,Macdonal-Bravo H.Changes in the nuclear distribution of cyclin/PCNA but not its synthsis depend on DNA replacation[J].EMBO J,1985,4(3):655-661.