pcDNA3.1-HIF-1α重组质粒的构建及其初步鉴定

刘荣福 占鹏程 李博安

(厦门大学附属第一医院泌尿外科，福建 厦门 361003)

缺氧诱导因子-1(HIF-1)是在缺氧状态下调节机体或细胞对缺氧反应中的一种核转位因子〔1〕，广泛表达于哺乳动物的各种组织细胞。HIF-1由α和β两种亚基组成的异二聚体蛋白，其中α亚基受缺氧或低糖调节，在缺氧时较稳定，活性大大增强〔2〕，通过与其下游的靶基因特定序列DNA结合而调控他们的转录和翻译，如血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生长素(EPO)、葡萄糖转运和糖酵解酶、诱导型 NO 合酶(iNOS)〔3〕，血管形成及糖酵解酶活性增加，使肿瘤细胞适应缺血缺氧环境，维持生存与发展的需要，这在肿瘤的发生发展中具有重要作用。本课题成功构建了HIF-1α过表达重组质粒(pcDNA3.1-HIF-1 α)并转染到前列腺癌细胞株(PC-3)，建立了pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3细胞株，为研究前列腺癌与HIF-1α提供了一个可靠工具。

1 材料与方法

1.1 材料 人PC-3、pcDNA3.1质粒、大肠杆菌DH5α由厦门大学生命科学院提供。HIF-1α鼠抗人抗体购自Santa Cruz公司，羊抗鼠IgG二抗购自武汉博士德公司，Fugene转染试剂购自罗氏公司，胶回收试剂盒、质粒抽取试剂盒均购自OMEGA公司，细胞总RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司，ECL试剂盒购自Pierce公司，胎牛血清、1640培养基系Gibco公司产品。实验所用试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 从Genbank检索出HIF-1αcDNA序列，根据Primer设计软件，HIF-1α基因上游引物:5'-CGGGATCCTCTCTAGTCTCACGAGGGGTTTCC-3';下游引物:5'-GCTCTAGAGATGCTACTGCAATGCAATGGTT-3'，两 端 引 入BamHⅠ和XbarⅠ酶切位点，扩增片段2.89 kb，由广州英骏生物公司合成。

1.2.2 HIF-1α片段扩增 采用TRIZOL试剂，裂解PC-3提取总RNA，经RT-PCR方法(具体操作参考RT-PCR试剂盒)扩增HIF-1α基因片段，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸4 min。循环35次。末次循环后72℃再延长10 min，依照胶回收试剂盒说明书回收扩增片段。

1.2.3 pcDNA3.1-HIF-1α重组质粒的构建及鉴定 将RTPCR扩增产物与pcDNA3.1质粒用BamHⅠ和XbarⅠ37℃双酶切过夜，胶回收酶切产物。在15μl的连接反应体系中，加入1.5μl 10×缓冲液，1μl T4DNA连接酶，9.5μl的PCR扩增产物，3μl的pcDNA3.1载体，4℃连接过夜，将连接产物转化至大肠杆菌DH5μα，摇匀，小量抽取质粒(具体步骤参照质粒抽取试剂盒)，酶切，菌落PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性重组子。

1.2.4 序列测定 由上海英骏生物公司完成。采用双脱氧链末端中止法，以DNA全自动测序仪测定核苷酸序列，同一片段经正反两个方向重复测定。

1.2.5 pcDNA3.1-HIF-1α重组质粒的转染 中量抽提鉴定正确的pcDNA3.1-HIF-1α真核表达质粒，纯化，取培养于6 cm培养板中处于对数生长期的PC-3细胞经Fugene转染(具体操作参考Fugene转染说明书)。转染后培养48 h，于倒置荧光显微镜下观察、计数发绿色荧光细胞数，每孔取5个视野，取其平均值计算转染效率，计算公式为:细胞转染率=(同一高倍镜下绿色荧光细胞总数/同一高倍镜下细胞总数)×100%。

1.2.6 重组质粒pcDNA3.1-HIF-1α的表达鉴定 Western印迹检测HIF-1α蛋白表达情况。取转染48 h处于对数生长期的pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3和pcDNA3.1-PC-3细胞，快速裂解法裂解细胞，13 000 r/min，30 min，4℃，用 Bradford法取上清液测蛋白浓度，按上样量一致加样，均为80μg，于8%的SDSPAGE 电泳，120 V，90 min，电泳完后转膜，300 mA，90 min，将膜置于5%的牛奶中室温封闭60 min，4℃兔抗人HIF-1α多克隆抗体(稀释度为1∶1 500)杂一抗过夜，TBST洗膜10 min×3次，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG(稀释度为1∶5 000)杂二抗60 min，Tris缓冲盐水(TBST)洗膜10 min×3次，ECL显影，曝光。

2 结果

2.1 HIF-1α扩增片段 PC-3细胞内抽提的RNA逆转录为cDNA，经PCR合成仪扩增HIF-1α片段，琼脂糖凝胶电泳分析，可见一条大小约2900bp的条带，见图1。

2.2 菌落PCR鉴定阳性克隆 4℃连接后转化大肠杆菌，铺板，挑取连接后的菌落采用PCR方法扩增HIF-1α片段，结果能扩增2.89kbp大小的片段的菌落为阳性克隆，即为连接有HIF-1α片段的重组质粒，见图2。

图1 PCR扩增产物

图2 菌落PCR

图3 重组质粒pcDNA3.1-HIF-1α酶切鉴定

2.3 HIF-1α重组质粒的酶切鉴定 取pcDNA3.1-HIF-1α阳性克隆小量制备质粒，经BamHⅠ和XbarⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳，所得结果与pcDNA3.1载体和HIF-1α片段大小一致，约5.3kbp和2.89kbp，经DNA测序证实HIF-1α扩增片段与Genebank公布一致。见图3。

2.4 转染效率的检测 质粒转染前列腺癌效率为(43.24±2.56)%，绿色荧光蛋白表达情况，见图4。

2.5 重组质粒pcDNA3.1-HIF-1α的表达鉴定 在pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3细胞内高表达，而在pcDNA3.1-PC-3细胞内条带较pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3弱，表明重组质粒 pcDNA3.1-HIF-1α在前列腺癌细胞内能够表达。见图5。

图4 质粒转染PC-3细胞48h绿色荧光蛋白表达情况

图5 PC-3细胞内HIF-1α蛋白表达情况

3 讨论

肿瘤细胞具有很强的增殖能力，在其发展过程中局部肿瘤组织生长超过周围血管生长速度，必然导致局部组织缺血缺氧，在该种缺氧情况下会诱导HIF-1α的表达，进而进入细胞核与HIF-1β结合，然后与其下游的靶基因的缺氧反应元件(HRE)的HIF-1α结合位点结合，促使VEGF表达及葡萄糖转运和糖酵解酶活性增加，血管形成及能量代谢增强，维持肿瘤细胞的生存和发展。此外，近几年研究还发现，HIF-1α过表达能抑制细胞凋亡〔4〕、调节细胞周期蛋白(Cyclin)〔5〕，影响肿瘤分裂以及干扰生长因子〔6〕合成与分泌，促进细胞生长等多种途径增强肿瘤生存能力。Zhong〔7〕研究发现在前列腺癌组织和癌前病变及癌远处转移的病灶中HIF-1α均有不同程度的高表达，而在正常的前列腺组织和良性病变中却未发现HIF-1α蛋白过表达，表明其与前列腺癌的发病之间有着密切的关系。

为了探讨HIF-1α与前列腺癌发病机制之间的关系，本实验构建重组质粒pcDNA3.1-HIF-1α，酶切，电泳，目的片段位于2.89kb左右，载体片段位于5.3kb，和预期结果一致，序列测定所扩增的HIF-1α片段与Genbank报道一致，然后经转化至大肠杆菌进行扩增，中量抽提，转染至PC-3细胞，48h后转染效率约为45%左右，重组质粒能够在细胞内表达，且其表达量要高于PC-3细胞。

随着人口老龄化、生活水平的提高，我国前列腺癌的发病率正逐渐上升，病死率较高〔8〕，而目前尚缺乏有效地治疗方法。HIF-1α在肿瘤细胞内高表达，可作为肿瘤生物研究的重要参照物〔9〕。成功构建HIF-1α稳定表达的重组质粒pcDNA3.1-HIF-1 α，将为研究HIF-1α与前列腺癌发病机制之间的关系提供了一个有力工具，并有望作为临床上前列腺癌的早期诊断指标和肿瘤标记物，间接为前列腺癌的早期诊断及治疗提供较大的帮助。

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3 Rankin EB，Giaccia AJ. The role of hypoxia-inducible factors in tumorigenesis〔J〕. Cell Death Differ， 2008; 15( 4) : 678-85.

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8 叶定伟，李长岭.前列腺癌发病趋势的回顾和展望〔J〕.中国癌症杂志，2007;17(3):177-80.

9 Semenza GL. Hypoxia-inducible factor 1 and cancer pathogenesis〔J〕.IUBMB Life， 2008; 60( 9) : 591-7.