蓝玉簪龙胆提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗菌作用的实验研究

刘菁菁，李旭波，耿 铮，张 弦，侯 颖，刘水冰，许文忠，田 琼

(1.第四军医大学药学系药理学教研室，陕西西安 710032;2.中国人民解放军66347部队，河北保定 071000;3.云南耿马县人民医院药剂科，云南 耿马 677500)

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)是医院、社区感染的主要病原菌，几乎对所有β-内酰胺类抗菌药物耐药，甚至累及到大环内酯类、喹诺酮类和氨基糖苷类等抗菌药物［1］，自1997年报道首例金黄色葡萄球菌对万古霉素敏感度降低后，其对替考拉宁也出现中介敏感［2－3］，这一现状成为临床亟待解决的问题之一。寻找新的抗耐药菌药物是各国药学研究者面临的重大任务，除了新型抗生素外，我国的中医中药正显现出独特疗效［4］。

蓝玉簪龙胆(Gentiana veitchiorumHemel)，系龙胆科龙胆属植物，生长于我国西藏中东部的高海拔草地中，药用部位为其干燥花及地上部分。味苦性寒、无毒，主治天花、气管炎、目赤头痛，咽炎，湿热黄疸等症［5］。在前期研究中，蓝玉簪对于慢性支气管炎、肺纤维化动物模型有较好的疗效［6－7］，由于细菌感染是慢性支气管炎、肺纤维化的致病因素之一，并且清热、解毒、燥湿类中草药有一定抑菌作用，本实验针对肺部疾病常见的MRSA感染，对蓝玉簪龙胆的抑菌作用做一研究。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1仪器DH-420型电热恒温培养箱，北京科伟永兴仪器有限公司;SW-CJ-1F工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;麦氏比浊管，西安市君利生物科技有限公司;电子天平、手术器械等。

1.1.2试剂胃粘蛋白(mucin)，Sigma公司，配成体积分数为0.05后121℃ 15 min灭菌，用于稀释菌液。M-H培养基(Mueller-Hinton Agar)，批号:20080326，北京奥博星生物技术有限责任公司;营养琼脂(Nutrient Agar)，批号:20080602，北京奥博星生物技术有限公司;Mueller-Hinton肉汤(MHB)，批号:080430，北京陆桥技术有限责任公司;用于MRSA的M-H肉汤及培养基加入体积分数为0.02的氯化钠。氯化钠，天津市津北精细化工有限公司。甲醛溶液，天津市红岩化学试剂厂;乙醇，批号:0806073301，安徽安特生物制品有限公司;石油醚，批号:20081222，天津化学试剂有限公司;乙酸乙酯，批号:20080228，天津化学试剂有限公司;三氯甲烷，批号:20080115，国药集团化学试剂有限公司;正丁醇，批号:20080430，天津津北精细化工有限公司，以上试剂均为分析纯。

1.1.3实验药品蓝玉簪龙胆采自西藏高原，为蓝玉簪龙胆的花及茎叶。蓝玉簪龙胆有机溶剂提取物制备:蓝玉簪龙胆1.5 kg，浸泡于30 L体积分数为0.75的乙醇中48 h，重复3次，收集滤液。旋转蒸发仪减压蒸馏至无醇浸膏，得640.21 g蓝玉簪乙醇提取物。蒸馏水溶解醇提物至8 L，依次用氯仿、正丁醇萃取，分别得到氯仿提取物72.13 g;正丁醇提取物57.92 g，水层提取物482.65 g。。蓝玉簪龙胆水煎液制备:称取蓝玉簪龙胆40 g水煎2次，滤液合并浓缩至250 ml，得到浓度为0.16 g·ml－1受试药物(相当4 g·kg－1)。注射用头孢唑啉，批号:8081037308，哈药集团制药总厂;银黄胶囊，批号:100101065，重庆陪都药业股份有限公司。

1.1.4动物清洁级昆明种小鼠50只，♀♂各半，体质量(20±2)g，动物:微生物控制为SPF级，由第四军医大学实验动物中心提供，SCXK(军)字第2002-5号。

1.1.5实验细菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA(国家细菌耐药性监测中心提供);甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌MSSA标准菌株ATCC29213(购自中国药品生物制品检定所)。

1.2方法

1.2.1体外实验:肉汤稀释法测MIC 每组排列无菌试管13只，除第1支试管外，每支试管内加MH肉汤2 ml。然后第1、2管中加入2 ml稀释的极性组分药液，依次倍比稀释至第13管(这时药物最高及最低浓度分别为:乙醇61.0～0.015 g·L－1、氯仿48.0 ～0.012 g·L－1、正丁醇 94.0 ～0.024 g·L－1，水层51.0 ～0.013 g·L－1)。用微量加样器取0.1 ml MRSA菌液(MRSA过夜培养后0.5麦氏比浊，再用M-H肉汤1∶10稀释，使之含量1010个·L－1)依次由低浓度到高浓度，最终接种菌量为5×108个·L－1。另取两支试管，做“肉汤对照”、“MRSA生长对照”，35℃孵育24h观察，以肉眼可见生长判定最低有效浓度MIC(minimal inhibitory concentration，MIC)。

1.2.2体内实验:感染小鼠保护实验① 感染菌液制备:将MRSA于实验前1 d接种于2 ml M-H肉汤中，35℃培养6 h，取菌液0.1 ml转接于10 ml肉汤中，35℃培养18 h，为增毒原菌液。于临用前，0.5麦氏比浊再适当稀释后用体积分数为0.05的mucin(以1份菌液与9份mucin混合)稀释至感染动物LD90所需的终浓度［8］。② 实验动物分组:前述小鼠♀♂各半，分别随机分成5组:感染模型对照组、蓝玉簪龙胆水煎液高、中、低剂量组，银黄胶囊阳性对照组，每组10只。③ 方法:每只小鼠腹腔注射0.5 ml感染菌液，随后分组给药，蓝玉簪龙胆水煎液组 4 g·kg－1［6］(原药)灌胃给药 0.5 ml，高剂量组每天4次，中剂量组每天3次，低剂量组每天2次;银黄胶囊阳性对照组灌胃给药0.75 g·kg－1，每天4次。逐日观察并记录感染小鼠存活数量，共15 d。之所以用银黄胶囊做阳性对照，是因为没有明确的用于MRSA的中草药，银黄胶囊由黄芩、金银花配方而成，在以往的体外研究中这两种草药均有很好的抗MRSA作用［9］。此外，在之前预实验中做过单独mucin注射对照，小鼠无死亡。

1.3统计学处理记录小鼠死亡或存活情况进行χ2检验判断。

2 结果

2.1体外抗菌作用肉汤稀释法结果发现，蓝玉簪龙胆各极性组分对MRSA和MSSA均有体外抗菌作用。结果见Tab 1。

Tab 1 In vitro antibacterial test(MIC/g·L－1)

蓝玉簪龙胆的各提取物对MRSA和MSSA的敏感性差异无显著性，可能是由于中草药在机体内的抗菌活性有别于抗生素［9］。其中，正丁醇组分的MIC值在各极性组分中最低，即有效浓度最低。

2.2蓝玉簪龙胆水煎液对小鼠腹腔耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的作用小鼠腹腔感染2 h后出现畏寒、寒战，10 h后眼睛有脓性物质分泌，活动减少，无进食，20 h后出现腹泻、体温降低等症状，并开始死亡。死亡小鼠尸检，各组小鼠的肝、肾均出现不同程度脓点，其他脏器未见异常。无菌操作取存活及死亡小鼠的心血，接种于琼脂平板，35℃孵育，24 h后存活小鼠的心血培养无菌落，死亡小鼠的心血均有菌落生长。治疗15d后结果见Tab 2，中剂量组与对照组相比较差异有显著性(P＜0.01)。

Tab 2 Protective effect of Gentiana veitchiorum Hemel on mice infected with MRSA(n=15)

3 讨论

在耐药菌大量涌现的情况下，我国传统中草药并没有出现明显的耐药情况，有研究者认为中草药除直接的抗菌作用外，还可增强机体的免疫力，有其独特机制［10－11］，这些可能是中草药不易产生耐药性的原因。本实验从体内、体外两部分证实了蓝玉簪龙胆的抗菌作用。体外肉汤稀释法显示，蓝玉簪龙胆各极性组分存在抑菌差异，由于苷类物质较易溶于正丁醇，生物碱较易溶于乙醇、氯仿，由实验结果推测蓝玉簪龙胆发挥抑菌作用的有效物质可能为苷类或生物碱，为该药有效成分分析做参考。感染动物实验显示，蓝玉簪龙胆各治疗组比对照组小鼠的症状稍轻、发病缓、恢复快，就死亡小鼠而言，有效延长死亡时间1～2 d。但在此实验中，高剂量组死亡率高于中剂量组，虽然蓝玉簪龙胆在之前的急毒、长毒实验中，均未出现毒副作用，但是对于感染小鼠，说明此药并非剂量越大疗效越好。对于银黄胶囊组，主成分黄芩、金银花，虽在体外抗MRSA研究中取得很好效果，但本次体内用药只是参考临床治疗上呼吸道疾病的用量，可能对于抗MRSA剂量还需调整，所以本次银黄胶囊的治疗不理想。

清热解毒中药常用于治疗感染性疾病，但体外抑菌实验效果差异较大，有些与抗生素联用往往能增强抗生素的杀菌疗效［12］。体外研究结果进一步促进了清热解毒中药的临床研究和应用，形成了中药“抗菌增敏”的概念［13－14］。蓝玉簪龙胆作为单方制剂，对于急症感染作用还是很明显的，本研究为临床控制MRSA感染提供了新思路。

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