人过氧化氢酶基因重组腺病毒的构建及其酶活性的测定

欧阳晓玲，李爱玲，宁启兰，杨旭东，许 楠，王慧莲

(1.西安交通大学医学院遗传与分子生物学系，陕西 西安 710061;2.陕西教育学院生物科学与技术系，陕西 西安 710061;3.郴州市第一人民医院，湖南 郴州 423000)

过氧化氢酶(catalase，CAT)是人体内一类非常重要的抗氧化物酶，是H202的重要清除剂，其主要分布在过氧化物酶体中［1］。有人用脂质体包埋的超氧化物歧化酶(SOD)和CAT通过静脉注射的方式，使暴露于100%氧气中的小鼠存活率明显上升［2］。另外，Ruh等人也通过静脉注射的方式将CAT用于非类固醇类消炎剂吲哚美辛诱导炎性肠胃道疾病的大鼠模型，发现其具有明显的减轻炎症区域的充血情况，起到抗炎作用［3］。本研究通过对含人CAT基因重组腺病毒载体的构建、重组腺病毒的包装、纯化及鉴定该酶的活性，为进一步研究人CAT基因在基因治疗中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂、载体和菌株 限制性内切酶EcoR V、Kpn I 和 Sal I，T4 DNA Ligation，pcDNA3.1+，DL 2000 均购自 TaKaRa公司。LR clonase II Enzyme mix，pENTR 1A 质粒，pAd/CMV/V5-DEST和pAd/CMV/V5-LacZ载体，脂质体2000 ，293A细胞系，感受态细胞DH5a和TOP10菌株均购自Invitrogen公司。

1.2 引物设计与合成 从GenBank数据库里获得人CAT基因的全长cDNA(NM 001752)，用Primer 5.0软件设计。正向引物 P1:5'-AAAGGTACCGCTATGGCTGACAGCC-3'包含酶切位点Kpn I，反向引物P2:5'-TTTGATATCCA GATTTGCCTTCTCC-3'包含酶切位点EcoR V，由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

1.3 目的基因的制备和 pCDNA3.1+-CAT的构建 从人血中分离白细胞，按RNA agent Total RNA isolation system试剂盒说明书指导提取总RNA，反转录成cDNA，PCR(94℃ 3 min，94℃ 45 s，56℃ 30 s，72℃ 90 s，35 个循环;72℃5 min)扩增出CAT的目的基因片段。用Kpn I和EcoR V酶消化目的片段和pCDNA3.1+空载体，胶回收、连接和转化后利用酶切和测序法鉴定阳性克隆。

1.4 含目的基因入门载体pENTR 1A-CAT的构建 用Kpn I和EcoR V同时消化pcDNA3.1+-CAT和入门空载体pENTR 1A，经胶回收、连接和转化后，在含卡那霉素的LB琼脂糖平板上筛选、挑取克隆、提取质粒并进行酶切鉴定。

1.5 含CAT基因重组腺病毒pAd/CMV/V5-DEST-CAT的构建 按照体外重组试剂盒LR clonase II Enzyme mix实验指导，对含目的基因的载体pENTR 1A-CAT和腺病毒空载体pAd/CMV/V5-DEST进行体外同源重组实验，挑取阳性克隆，利用DNA测序法确定目的基因序列是否整合在载体的正确位点上。

1.6 pAd/CMV/V5-DEST-CAT在293A细胞中包装、扩增及滴度测定 将 Pac I线性化的pAd/CMV/V5-DEST-CAT与脂质体2000 共转染293A细胞，培养10 d后收集感染的293A细胞。经反复冻融收集含病毒颗粒的细胞裂解液，再用100 μl该裂解液感染293A细胞进行病毒的扩增，2～3 d后可见90%细胞变圆，串珠状脱落，反复冻融收集病毒，－80℃长期保存。用TCID50法测定第一代病毒滴度。

1.7 免疫印迹法检测 pAd/CMV/V5-DESTCAT中CAT蛋白质的表达 用RIPA蛋白提取试剂盒提取经重组腺病毒pAd/CMV/V5-DEST-CAT感染293A细胞的蛋白，用BCA法定量蛋白，进行免疫印迹实验。即以10%的SDS聚丙稀酰胺凝胶分离蛋白质，再将蛋白转移到polyscreen PVDF膜上，将PVDF膜浸在含0.1%Tween-20的 PBS(简称 TBS液)中1 h。然后，将膜放入初级抗体溶液中4℃孵育过夜，用TBS液洗2次后，再在二级抗体液中培养1.5 h，用TBS洗3次。用ECL检测试剂盒检测CAT蛋白条带的免疫强度，并用ChemiImager成像系统采集实验结果所得的图像，再用相关的软件(a-Innotech)对图像中的免疫强度进行分析。

1.8 测定pAd/CMV/V5-DEST-CAT的CAT活性 在100 mm培养皿中种5×105个/L 293A细胞，用100 μl的病毒粗提液感染细胞，24 h后收集细胞，PBS洗2次。细胞在500 μl PBS中重悬，冰上用100%功率超声破碎细胞15 min，得正常对照组、pAd/CMV/V5-LacZ感染组和pAd/CMV/V5-DEST-CAT感染组3组细胞裂解液。每组取3个5 ml的试管，分别标记为S1、S2(2个平行实验组，分别加入0.2 ml细胞裂解液、1.5 ml pH 7.8 磷酸和 1.0 ml蒸馏水)和 S0(加入0.2 ml煮沸细胞裂解液，1.5 ml pH 7.8磷酸，1.0 ml蒸馏水)，每加 1 管时立刻计时，并迅速倒入石英比色皿中，在紫外分光光度计上测定各试管在240 nm下的光吸收值，每隔1 min读数1次，共测4 min，重复测定3次。最后，依据公式△A240=AS0－(AS1+AS2)/2的值，绘制CAT活性曲线。过氧化氢酶活力单位定义为:每毫升细胞粗蛋白液每分钟分解1 μmol H2O2的量为1个活力单位，按照公式(空白管吸光度－样品管吸光度)×CAT分子量/反应时间/样品中的蛋白毫克数。

1.9 统计分析 实验数据以均数±标准差表示，用SPSS 13.0统计软件进行处理，在单因素方差分析的基础上，用q检验-多重比较法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 目的片段的获得 RT-PCR法扩增出CAT基因的目的片段，所扩增出的片段与预期1585 bp大小相符(图1)。

图1 DNA凝胶电泳图显示RT-PCR的结果Fig.1 Diagram of DNA gel electrophoresis shows the result of RT-PCR

2.2 酶切和DNA测序鉴定 pcDNA3.1+-CAT阳性克隆 pcDNA3.1+-CAT阳性质粒经Kpn I和EcoR V双酶切后，释放出1586 bp目的基因片段和5385 bp的空载体片段(图2)，可以确定目的基因已经连接到该载体上。随后阳性克隆基因测序的结果进一步确定，插入到载体pcDNA3.1+多克隆位点上的目的基因序列完全准确。

2.3 酶切法鉴定pENTR1A-CAT阳性克隆pENTR1A-CAT阳性质粒经Kpn I和EcoR V双酶切后释放出1586 bp目的基因片段和2253 bp的空载体片段，说明目的基因已成功地连接到入门载体上。pENTR1A-CAT阳性质粒经SalⅠ和EcoR V双酶切后，SalⅠ的酶切位点在载体上，而EcoR V位点是目的基因连接位点;与经Kpn I和EcoR V双酶切释放的片段之差十几个碱基，但电泳结果几乎相同，显示目的基因插入的方向是正确的(图3)。

图2 pcDNA3.1+质粒和质粒酶切后的DNA凝胶电泳图Fig.2 Diagram of DNA gel electrophoresis shows plasmid DNA of pcDNA3.1+and pcDNA3.1+-CAT/Kpn I+EcoR V

2.4 DNA序列测定法鉴定重组的pAd/CMV/V5-DEST-CAT载体 挑出pENTR 1A-CAT和腺病毒pAd/CMV/V5-DEST经体外重组实验(LR)反应后，再经氨苄青霉素和氯霉素双抗生素正负筛选，测序阳性克隆的基因，证实CAT基因如期整合到腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST的位点，且目的基因插入的方向正确，说

图3 pENTR1A-CAT质粒经酶切后的DNA凝胶电泳图Fig.3 Diagram of DNA gel electrophoresis shows plasmid DNA of pENTR1ACAT after digestion

图4 293A细胞转染7d后的细胞形态图Fig.4 Morphology of cells after infection for 7 days

2.6 免疫印迹检测重组pAd/CMV/V5-DESTCAT中目的蛋白质的表达 含目的基因CAT的pAd/CMV/V5-DEST-CAT感染293A细胞24 h后，其目的蛋白过氧化氢酶在该细胞中得到了高表达(图5)。

图5 Western blot法检测重组腺病毒转染的293A细胞中CAT的表达Fig.5 Western blot analysis of 293A cells after pAd/CMV/V5-DEST-CAT infec-tion

2.7 Ad/CMV/V5-DEST-CAT的 CAT活性测定 图6显示:采用Ad-CAT、(A组)Ad-LacZ(B组)及PBS(C组)感染293A细胞24 h，其细胞蛋白提取液在1至4 min反应中CAT活性的变化。三组间CAT活性经单因素方差分析结果显示:F=5.96，P ＜0.05。其中，A 组 4 min内的酶活性分别比B组和C组高出(63.8±1.54)% 和(76.7 ±1.67)%(P ＜0.05)，而B组和C组的平均酶活性无显著性差异(P＞0.05)。这说明被Ad-CAT重组腺病毒感染的293A细胞裂解液中含有较强的CAT活性。

图6 CAT活性测定曲线图Fig.6 Diagram ofactivity determination for catalase

3 讨论

目前大量的临床资料和基础研究表明，人类癌症、衰老、肥胖、各种炎症以及自身免疫性疾病等多种疾病的产生与自由基有关。CAT是人体内非常重要的一类抗氧化物酶，许多实验结果表明CAT在抗氧化损伤引起的各种疾病的治疗上具有重要意义。Roscoe等人在免疫复合物诱导急性肺损伤的大鼠模型中注射牛肝CAT，结果发现其能明显地减少炎症反应中嗜中性白血球及减轻肺泡的损伤，具有抗急性氧化损伤的作用［5］。Joanne等研究证明，CAT在细胞模型中能逆转恶性肿瘤细胞株的致瘤性［6］。本研究利用通路克隆系统高效、准确地构建了含人抗氧化物酶基因的重组腺病毒表达载体，并且获得了高滴度和高纯度的含人CAT基因重组腺病毒株。为进一步揭示氧化应激在一些疾病发生发展中的作用机制和对一些疾病的基因治疗的研究打下了坚实的基础。

目前用于基因治疗的病毒载体主要有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、单纯疱疹病毒载体等;其中，以逆转录病毒载体及腺病毒载体最常用。腺病毒载体由于具有宿主细胞广泛、可感染静止及分裂期细胞、繁殖滴度高、性质稳定、包装容量大及不整合等优点，而被广泛应用的在基因治疗中，尤其是用于体内基因的治疗研究。

本研究采用基于attL X attR的λ噬茵体位点特异性重组系统的Gateway TM技术［4］，在高效重组酶作用下体外进行同源重组，形成重组腺病毒表达载体。从而避免了繁杂的筛选和鉴定过程，节约了大量的人力、物力和财力。

［1］ANISIMOV V N，ZAVARZAIN N.Melatonin increases both life span and tumor incidence in female CBA mice［J］.J Gerontol A Bioi Sci Med Sci，2001，56(7):B311-B323.

［2］TURRENS J F，CRAPO J D，FREEMAN B A.Protection against oxygen toxicity by intravenous injection of liposome-entrapped catalase and superoxide dismutase［J］.J Clin Invest，1984，73:87-95.

［3］RUH J，VOGEL F，SCHMIDT E，et al.Effects of hydrogen peroxide scavenger catalase on villous microcirculation in the rat small intestine in a model of inflammatory bowel disease ［J］.Microvascular Research，2000，59(3):329-337.

［4］WANG Zong-gui，ZHENG Wen-ling，MA Wen-li(汪宗桂，郑文岭，马文丽).Gateway cloning system:recentadvanceofDNA recombination technology［J］.Journa of China Biotechnology(中国生物工程杂志)，2003:23(7):24-27.(in Chinese)

［5］ROSCOE L.Time-dependent inhibition of immune complex-induced lung injury catalase:relationship to alterations in macrophage and neutrophil matrix metalloproteinase elaboration ［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，2000，29(1):8-16.

［6］JOANNE S F，Margaret E T，Kevin A K，et al.Catalase reverses tumori-genicity in a malignant cell line by an epidermal growth factor receptor pathway［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，2006，40:863-875.