脂联素基因突变-11377C/G检测方法建立及与2型糖尿病关系的研究

裴 林,乔博明,贾 玫*,张 旗

(北京大学人民医院 1.检验科;2.中心实验室,北京100044)

脂联素(adiponectin,APN)是新发现的一种脂肪细胞表达的细胞因子,与肥胖、胰岛素抵抗(IR)、2型糖尿病(T2DM)等疾病密切相关[1-3]。编码人脂联素的基因为aPM1,位于染色体3q27,由3个外显子和2个内含子组成。全基因组宽带扫描显示该区域存在T2DM和代谢综合征的易感位点[4-7],提示aPM1多态性与T2DM可能存在相关性。目前,已发现10余个脂联素基因单核苷酸多态性(SNPs)位点及一些罕见的错义突变。有研究认为,启动子区域的SNPs、SNP+45及SNP+276和部分错义突变与2型糖尿病和(或)胰岛素抵抗存在相关关系,这种相关性主要由于突变影响了脂联素的表达水平及其功能。

近年来国外研究发现aPM1启动子区域存在-11377C/G多态性,并证实该多态性与肥胖、胰岛素抵抗和T2DM有关。本研究旨在建立ARMS-TaqMan检测aPM1-11377C/G多态性方法并探讨血清脂联素水平及aPM1-11377C/G多态性与T2DM的相关性。

1 资料与方法

1.1 对象

来源于2009年1月至2009年12月我院内分泌科住院患者及我院健康体检者。分为糖尿病组(T2DM)和对照组(NC)。 ①T2DM 组:156人(男87/女69),依照1999年WHO糖尿病诊断标准[8]。②NC组:89例(男21/女 68),空腹血糖(FBG)＜6.1 mmol/L,无糖尿病史。

1.2 方法

1.2.1 测定身高、体重、计算体重指数,测定腰围、臀围,计算腰臀比。

1.2.2 血液生化指标的测定 血清脂联素水平检测方法为ELISA法,由美国RD system公司提供。空腹胰岛素(FINS)和餐后2 h胰岛素(PINS)测定使用罗氏2010型电化学发光仪,所用试剂由罗氏公司提供。总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FBG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋

白胆固醇(LDL-C)测定使用日立7170全自动生化分析仪,所用试剂由日本和光公司提供。HbA1C测定使用高压液相亲和层析法,所用试剂由美国Primus公司提供。

1.2.3 人全血标本基因组DNA的提取 采用日本东洋纺(TOYOBO)磁珠法提取,采用EDTA-K2抗凝新鲜全血标本,提取基因组DNA标本-80℃保存备用。

1.2.4 人aPM1-11377C/G点突变不同基因型质粒标准品的获取 等位基因野生型质粒标准品:上游引物 5′AGAACCGGCTCAGATCCTGTC3′;下游引物 5′GTGTGGGGCTTGGCAAGTTAA3′(上海生工)。PCR扩增产物与pGM-T载体(北京天根)连接后转化到DH5α大肠杆菌进行克隆,提取质粒经测序确定后作为等位基因野生型质粒标准品。等位基因突变型质粒 标 准 品:上 游 引 物 5′AGAACCGGCTCAGATCCTGTG3′;下 游 引 物 5′AGCAGCCTGGAGAACTGGAAG3′,其余同上。等位基因杂合型质粒标准品:将等量野生型和纯合突变型质粒标准品混合作为等位基因杂合型质粒标准品。对不同基因型质粒标准品配制成5×107copies/ml,-80℃保存备用。

1.2.5 引物及TaqMan探针设计 引物设计采用Primer Premier5.0软件,由上海生工合成,北京赛百盛合成TaqMan探针。-11377C/G点突变扩增片段长度139 bp,野生和突变上游引物3′端-2位引入错配碱基”T”(正配碱基应为”C”)。TaqMan探针与上游引物扩增的模板链互补。TaqMan探针5′端标记荧光报告基团FAM,3′端标记淬灭基团TAMRA(表1)。

表1 ARMS-TaqMan方法检测aPM1基因C-11377G点突变引物及探针序列表

1.2.6 ARMS-TaqMan方法反应体系及测定条件反应体系 25 μ l,包括 2.5 ×RealMasterMix 10 μ l,上 、下游引物各 0.4 μ M,TaqMan prob 0.8 μ M,模板 2.5 μ l,使用 BIO-RAD Opticon 2荧光定量PCR仪检测TaqMan探针FAM荧光信号。反应条件94℃10 min,94℃30 sec,60℃60 sec,40个循环。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 组间生化指标比较 见表2。

表2 T2DM组和对照组间基本资料比较(x—±s)

2.2 基因型分组临床资料比较 见表3。

表3 基因型分组临床资料比较(x—±s)

2.3 aPM1-11377C/G点突变CC、CG、GG 三种基因型APN水平比较 245例调查对象中,共检测到GG、CG、CC 基因型分别为11例 、88例和 146例,单因素方差分析显示,从CC、CG、GG基因型的APN水平呈趋势性降低(9.72±5.52 mg/L,6.86±4.00 mg/L,4.29±2.18 mg/L,P＜0.001)。

2.4 ARMS-TaqMan方法检测aPM1-11377C/G点突变 见图1。分别显示不同质粒标准品在5×107copies/ml浓度时不同引物对不同基因型的循环阈值(CT值)变化情况。由图中可见,根据有无指数扩增期及CT值,可明确将CC、CG、GG三种基因型进行区分。

2.5 T2DM组和对照组aPM1-11377C/G基因型及等位基因频率比较 见表4。

图1 aPM1-11377 C/G点突变不同等位基因质粒标准品型荧光定量PCR扩增曲线图(5×107copies/ml)

表4 T2DM组和对照组aPM1-11377C/G基因型及等位基因频率比较

3 讨论

目前检测SNP的方法有单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性分析(PCRRFLP)和变性高效液相色谱分析(DHPLC)等,但PCR-SSCP重复性较差;PCR-RFLP只能对含有酶切位点的SNP进行分型,而aPM1在-11377位点附近无酶切位点;DHPLC不能确定SNP的位置和类型,且只能检测杂合突变,故本研究未选用上述方法。

ARMS-PCR的测定原理是基于错配出现在引物3′端时,引物将不能延伸。为了增加扩增特异性,本研究还在引物3′端-2位引入了错配碱基T。扩增产物经测序确定,准确性和特异性均较高。本研究通过对野生型和突变型基因进行质粒连接、转化、增菌、提取质粒、测序确定等步骤,获得了 aPM1-11377C/G野生型和突变型质粒标准品,为进一步检测临床标本提供了质量保证。

本研究所用ARMS-TaqMan PCR技术,通过对引物3′端正配与错配的扩增效率差异的比较鉴定SNP,且可以定量检测。该技术准确度高,适合样本多、位点数量少的检测。采用本方法检测 aPM1 SNP,国内尚无人采用。与上述方法比较,该方法灵敏、简便,重复性好,交叉污染少,易于自动化,由于本研究获得了人aPM1-11377C/G点突变不同基因型质粒标准品,故可应用于临床,为今后的定量检测奠定了基础。

本文研究显示aPM1-11377C/G突变对糖脂代谢均有影响,T2DM组血清脂联素水平低于对照组(P=0.019),与 Weyer、Pellme 和 Daimon[9-11]的研究结果相符。而Looker等[12]在对有T2DM的Pima印地安人所做的研究表明,在血糖调节受损或糖尿病病程＜10年的患者中最低,在糖耐量正常或糖尿病病程至少10年的患者中最高,提示T2DM患者血清脂联素水平与病程相关,而病程大于10年的患者血清脂联素水平不降反升,可能与糖尿病肾脏损害,引起肾小球滤过率下降,进而引起脂联素排泄障碍有关,具体机理有待进一步研究。

本研究显示aPM1-11377C/G基因多态性与T2DM发生相关,G等位基因频率百分比与T2DM呈正相关。对照组和T2DM组apM1-11377C/G基因多态性发生频率分别为19.11%和24.36%,该频率与日本人报道一致[13],与德国人[14]和瑞士高加索人[15]不同,说明该位点存在一定的种族差异性。

综上所述,aPM1-11377C/G多态性及血清脂联素水平与T2DM存在一定的相关性。本研究通过标准质粒的获得、ARMS-TaqMan PCR检测 aPM1-11377C/G多态性方法的建立,对临床检测aPM1-11377C/G多态性,预测T2DM提供了初步的科学依据。本研究与国内外大量研究皆表明脂联素在肥胖、T2DM、心血管疾病患者血中水平下降,脂联素是脂肪细胞因子中唯一一个在病理状态下浓度降低的因子,提示我们今后可能通过补充脂联素来作为治疗T2DM的方法之一,因此本研究对于T2DM患者今后的用药提供了初步的科学依据。

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