用猪小肠细胞外基质膜(ECM）修复家兔缺损胸壁的实验研究

吴金凤,薛锦儒,崔建华*

(1.长春大学医院,吉林 长春 130022;2.吉林大学中日联谊医院 胸外科,吉林长春 130033）

天然的细胞外基质膜(ECM）亦称脱细胞基质膜或组织支架,主要取自动物的小肠或膀胱,是一种去除细胞成分的基质膜,主要由Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ型胶原和丝蛋白构成。用ECM修复因伤病所致的组织缺损,不仅能恢复其解剖形态还能随着宿主组织器官的生长而生长,从而恢复或部分恢复所修复器官的生理功能,因此ECM组织支架的应用正在为外科学的发展提供一个全新的理念和更广阔的拓展空间。

胸壁肿瘤、外伤所造成的胸壁部分缺失、肺癌或乳腺癌侵及胸壁,乳癌术后过度放疗等原因造成胸壁缺损的情况,在临床上并非少见[1]。传统的方法多以人工材料修复或以转移皮瓣、带血管蒂的游离肌皮瓣修复。然而,前者修复范围有限,后者又以牺牲一部分健康组织为前提,有“拆东墙补西墙”之虞。用组织工程的方法制成ECM膜片修复胸壁缺损,是近年来国外研究的新热点,在以往的研究中多主张用“三明治方法”双层修复,但由于不同的胸壁组织所承担的生理功能不同,细胞生长与组织愈合周期也不同,因此对不同的胸壁组织如胸膜、肌肉组织、骨组织等分别加以修复似乎更为合理,我们用家兔为动物模型对此进行了研究。

1 材料与方法

1.1 猪小肠ECM的制取、灭菌与保存

体重30-40 kg的地产杂种猪6头,全麻下气管插管机械通气,按无菌手术的要求剃毛备皮。正中开腹切取屈氏韧带远侧小肠100 cm,以生理盐水冲洗肠内容,按10 cm长度将小肠分割成10段,浸于4℃生理盐水中。每段小肠从侧方剖开,在特制的装置固定下,以自制的刮除器仔细剔除小肠粘膜与浆肌层,取出ECM。将4层ECM挤压成膜片并经真空冻干24小时,装入密封的塑料袋中。经直线加速以8000拉德放射剂量照射灭菌后,常温下保存。

1.2 用猪小肠ECM膜片修复兔的缺损胸壁

新西兰白兔12只,雌雄兼用,体重5-8 kg,分为2组。肌注开他敏(1 mg/kg）诱导麻醉,气管插管吸入乙氟醚维持麻醉。动物剔毛,胸部皮肤消毒铺无菌巾。在右胸中部包括5-7肋骨,分层依次切除皮肤、皮下组织、胸肌、肋骨、胸膜进入胸腔,电凝止血,造成胸壁直径3.5 cm缺损。实验组:剪取3.5×3.5 ECM膜片,从内到外依次分3层分别修复胸膜和肋间肌及肋骨、胸肌、皮下组织与皮肤,其中肋骨的修复是先将ECM缝成管状,从两端将肋骨套入,再敷以生物胶,缝线选用6-0 Proline线。对照组:剪取3.5×3.5 ECM 膜片,用双层“三明治法”缝合,内层衬于胸膜,外层覆于皮肤,以6-0 Proline线均匀缝合8针,最后一针结扎前经气管插管吹肺,使右肺充分膨胀,两组均未放置胸腔引流管。术后经静脉给予头孢氨苄(35 mg/kg）一次/日,持续7天。术后60天将动物处死,切取胸壁修复处标本,运用形态学、组织学和生物力学等方法对标本进行观察。实验组和对照组分别在胸壁缺损修复处切取组织标本。组织学标本以40%甲醛固定,石蜡包埋,制成3 μ m石蜡切片,常规HE染色,光学显微镜下进行组织学观察。由于新生的胸膜与肋间肌以及新生的肋骨已经成为一体,难以分离解剖,因此两组静态单轴力学测试标本分别取自再生胸壁的内层和外层,游标卡尺测量其厚度(0.5±0.1）mm,将其浸泡于25℃缓冲液中固定在Instron5848力学实验系统上,夹持间距8 mm,以5mm/min速度拉伸,再通过曲线计算最大负荷和最大应力。

统计学处理;检测数据采用均数±标准差表示,组间比较分别行t检验和 χ2检验,以P＜0.05有统计学意义。采用SPSS10.0统计软件分析。

2 结果

24只实验动物全部存活到术后60天,无明显感染,饮食体重均正常。

2.1 大体观察两组动物胸壁缺损处ECM补片已无法辨认,组织生长平展、均呈瘢痕样愈合,无毛发生长,未见反常呼吸运动。实验组缺损修复处胸壁明显比对照组厚,前者为4.31±0.14 mm;后者为3.58±0.11 mm(P＜0.05）。

2.2 组织学观察实验组与对照组镜下均难以区分不同组织结构,纤维密度均匀,排列规则,与周围组织分界不清,靠近边缘处肌纤维增多,并见到较多的鳞状上皮细胞和炎症细胞浸润。在实验组切片镜下见到条状和桥状钙化,均出现在横切面的中央,相当于肋骨的深度,而对照组均未见钙化现象。

2.3 生物力学观察由于肉眼难以区分不同组织结构,两组间生物力学测试标本分别取自相当于胸膜和肋间肌及肋骨床的内层;相当于胸肌和皮肤的外层。内层测试最大负荷:实验组为8.46±1.01(N）;对照组为6.49±0.47(N）(P＜0.05）;外层测试最大负荷:实验组为5.32±0.76(N）;对照组为5.07±0.85(N）(P＞0.05）。内层测试最大应力:实验组为3.22±0.11(MPa）;对照组为2.13±0.27(MPa）(P＜0.05）;外层测试最大应力:实验组为3.32±0.76(N）;对照组为3.07±0.85(N）(P＞0.05）。

3 讨论

外科治疗胸壁缺损,传统上都是用自身正常组织进行修复,或是用人工合成的高分子材料修复。随着组织工程技术的发展,这种以牺牲部分健康组织为代价的“以伤疗伤”的理念正在被改变;而以人工合成材料修复病损的方法也存在一系列的缺陷,尤其是合成材料不能随宿主组织器官的生长而相应增长,因此限制了它们在年幼病人体内的应用,或是在年幼病人成长过程中需再次乃至多次更换人工合成材料。ECM是一种良好的组织工程材料,来源于异种动物的ECM具有取材广泛,灭菌后可长期保存,可进行商品化生产等特点,可应用于外科创伤、烧伤、整形、器官修复等多个领域,由于去除了细胞成分,ECM不具有抗原性[2-4]。我们用猪的小肠制取ECM,因为(1）从分子生物学的角度来看,猪的基因组与人类相近;(2）猪的来源丰富;(3）猪的生长过程可人为控制,取自不同体重和不同成熟状态猪的小肠ECM可用于不同年龄段和不同体重的病人。

从本实验的结果可以看出,ECM植入体内后起到组织支架的作用[5-6],其周围的相邻组织细胞可以沿组织支架移行和生长,最终将胸壁的缺损完全修复。然而不同的组织细胞生长速度不同,肌肉组织和皮肤生长速度似乎较骨组织和胸膜组织生长更快些,因此镜下见到较多的横纹肌细胞和皮肤再生的鳞状细胞,代表胸膜再生的间皮细胞未见到,而代表肋骨再生的镜下所见仅在实验组见到条状和桥状钙化。其次,不同的外科修复方式也影响修复的结果,本实验中,实验组将胸壁不同的组织分别加以修复,结果胸壁缺损处明显厚于对照组(P＜0.05）,生物力学测试结果也表明,分别加以修复者,其胸壁内层负荷-应变力优于对照组,说明用此种方法修复缺损的胸壁,对胸壁顺应性的影响小。胸壁的构建不仅需要封闭创口,还需要构建骨性胸廓,后者对于维持正常的胸壁顺应性和呼吸功能具有重要意义。实验组切片上见到的钙化,说明在ECM的诱导下,肋骨的再生是可以实现的。因此本实验可以得出这样的结论:不同的胸壁组织分别用ECM加以修复,明显优于内外两层“三明治”式的修复方法。尚需说明,无论采取何种修复方式对毛囊再生均无影响,因为两组在缺损修复处均未见到新生的毛发。

国内外用ECM修复胸壁缺损仍处于临床前研究阶段,要真正用于临床还有许多问题需要解决,譬如:在修复胸壁的过程中需要多长时间ECM可吸收殆尽?ECM最大可修复的范围占胸壁的百分比是多少?胸壁两种不同修复方式对呼吸功能的影响有何不同?对这些需要在今后的研究中进一步加以证明。

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