红霉素诱导呼吸道分离金黄色葡萄球菌耐药状况研究

王 轶,刘珊珊,黄 瑾

(中山大学附属第五医院1.ICU;2.呼吸科,广东 珠海519000)

本研究以红霉素为代表,探讨金黄色葡萄球菌在不同药物浓度下耐药产生的比率及何浓度下更容易诱导耐药,并探讨对红霉素高度耐药的菌株是否有遗传稳定性,及对其他种类的抗生素有无交叉耐药,以期对临床医生用药给予一定的指导。

1 材料与方法

1.1 受试菌株 标本为从我院临床呼吸道标本中分离出的对红霉素敏感(MIC≤0.5 μ g/ml)的菌株4株,来自晨起痰标本、纤维支气管镜吸取痰标本、支气管肺泡灌洗液。标准菌株ATCC 29213来自卫生部临床检验中心。菌株均经过革兰氏染色及美国BD公司生产的Phoenix100全自动微生物鉴定仪通过鉴定/药敏复合板鉴定及测定MIC值,试验前再次采用NCCLS M-27A方案,用琼脂稀释法对试验菌株进行药敏试验[1]。

1.2 诱导方法 含红霉素的药物琼脂平皿从四分之一MIC(0.125 μ g/ml)开始,以 2倍连续稀释浓度配制,把临床分离的菌株与标准菌株在不同药物浓度含药平皿中各接种5-10代,每株菌株同时设空白对照组,于每个药物浓度传代后测MIC值的变化[2],以 8 μ g/ml≤MIC ≤16 μ g/ml为低度 耐药 ,16 μ g/ml≤MIC ≤64 μ g/ml为中度耐药 ,MIC ≥256 μ g/ml为高度耐药。成功诱导后,再测定耐药突变株的遗传稳定性及对其他种类抗生素包括青霉素类、头孢类、氨基糖甙类、喹诺酮类等有无交叉耐药。

2 结果

4株敏感菌株及1株标准菌株在不同浓度梯度的培养皿中多次传代后,获得了抗不同浓度红霉素的耐药突变菌株。5株菌株最后的MIC值分别为2株 MIC ≥256 μ g/ml,2 株 4 μ g/ml＜MIC ＜8 μ g/ml,1株16 μ g/ml＜MIC ＜32 μ g/ml。同时做空白对照的只在空白培养皿中的5株菌株的MIC值分别为3株2 μ g/ml＜MIC ＜4 μ g/ml,1 株 1 μ g/ml＜MIC ＜2 μ g/ml,1株 0.5 μ g/ml＜MIC ＜1 μ g/ml。耐药突变菌株经遗传稳定性测定后发现其获得的耐药性是稳定的。诱导前后的菌株均未对其他种类抗生素发生交叉耐药。

3 讨论

临床抗生素的不合理使用及滥用使得耐药菌株不断增加,特别是近年来革兰氏阳性球菌感染不断上升,约占医院感染的40%,已经重新成为医院感染的主要病原菌,其中金黄色葡萄球菌占所有革兰氏阳性球菌感染的第一位[3]。

大环内酯类抗生素不良反应少、半衰期长、临床适应证广而仍被使用在金葡菌的社区感染和医院感染的敏感菌株上。所有CAP指南都推荐用大环内酯单一疗法治疗门诊或住院病人[4]。红霉素在细胞中的作用方式有两种[5]:一是抑制50S核糖体大亚基的形成;另一个是抑制核糖体的翻译作用。安全性和有效性使大环内酯得到广泛的应用,而耐药性也相应增加。抗性细菌主要通过影响红霉素在胞内的积累(大环内酯的外排机制)、破坏红霉素的结构使其失去抗菌作用、改造或修饰红霉素在核糖体上的结合作用位点来消除环境中的红霉素抗菌作用。

以往金黄色葡萄球菌耐药性的研究,多采用不匹配的菌株,这些菌株背景复杂多样,其耐药性的产生受多种因素影响,如不同来源、不同患者的用药情况、患者的依从性等。本实验采用人工诱导耐药的方法,通过考查同一菌株在药物的选择压力下,由敏感到耐药的演变过程,复制金黄色葡萄球菌的耐药模型,为其耐药机制的研究奠定基础,为临床合理用药提供可靠的理论依据。

对耐药菌的出现,人们通常习惯认为是抗生素杀死了敏感菌,而将耐药的菌群亚株选出来,即耐药株是先天存在的,而非后天的适应性改变[6]。本实验金黄色葡萄球菌在药物选择压力的作用下,为了使自身适应生存环境,通过一系列的方式如改变自身基因结构去适应环境,即产生耐药性,且根据结果可以看出高度耐药菌株的一半在二分之一MIC时产生,从而确认所谓小剂量预防用药是错误的。

在本实验初始,敏感菌在较高含红霉素浓度(≥0.5 μ g/ml)培养均不能生长,说明足够浓度的抗菌药物可有效杀灭致病菌,提示临床上在选择合理、足量地应用抗菌药物才能有良好疗效。实验结果的敏感菌从低至高逐级红霉素浓度培养,非但不能杀灭金黄色葡萄球菌,反而筛选出的高度耐药菌生长,这说明了剂量不足、给药方法等不合理的应用抗菌药物是导致致病菌耐药性出现的重要原因之一,结果严重影响临床疗效。

本实验通过体外耐药性诱导获得的金黄色葡萄球菌耐药株,有1株在二分之一MIC浓度时诱导耐药,1株在2MIC时诱导耐药,说明临床用药时,无论是剂量不足还是剂量过大,都有可能诱导细菌变异,特别是在剂量不足的情况下。同时,对剂量过大诱导的耐药,因考虑到细菌单纯传代时也可引起细菌的MIC变化,故在大剂量药物引起细菌耐药的过程中有无此因素的参与尚不确定,临床上尚不能完全参考此结果。

高度耐药菌株诱导成功后,在无药培养基中经5次传代,其MIC值不发生改变,说明菌株的获得性耐药具有稳定性。此稳定性提示临床用药时,即使间隔一段时间再用同类药物仍不会有明显疗效。将诱导后的耐药株测定对非诱导药物的MIC,并比较诱导前后MIC的比值,其他抗生素的MIC无明显变化,说明红霉素与其他抗生素无交叉耐药,说明在临床上感染严重时可以联合用药以提高疗效。此与何礼贤[7]的研究结果以及2001年美国胸科学会修订的《成人社会获得性肺炎处理指南》中的观点一致[8]。

在空白平皿中单独传代也导致敏感菌株的MIC值较前有较大的变化,说明临床用药过程中,细菌可能随着细菌传代引起耐药,使治疗效果不尽人意,提示临床用药时,可以随着治疗的过程延长,增加用药的剂量以保证治疗效果。

综上所述,现革兰阳性球菌的感染不断增多,耐药率逐年升高,目前治疗耐药革兰阳性菌感染新药虽不断问世,然而对耐药菌感染的控制并不能仅依赖于高效新药,严格掌握适应证,根据患者病情、病原菌药敏结果合理选用药物,有指征预防用药,监测细菌耐药性、掌握耐药机制等综合措施的实施,才能提高耐药菌感染的防治水平,减缓细菌耐药性的增长。

[1]陈民钧.美国临床实验室标准化委员会2004年版有关药敏试验标准化更新要点[J].中华检验医学杂志,2004,27(9):608.

[2]临床实验室标准化协会.抗微生物药物敏感试验的执行标准;第十六版信息增刊.CLSI文件 M100-S16(ISBN 1-56238-556-7).2006,26(3):37-41.

[3]倪语星.葡萄球菌研究进展[J].中国处方药,2005,44(11):18.

[4]中华医学会呼吸病学分会.社区获得性肺炎诊断和治疗指南[J].中华结核和呼吸杂志,2006,29(10):651.

[5]Matsuoka M,Inoue M,Nakajima Y,et al.New erm Gene in Staphylococcus aureus clinical isolates[J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46(1):211.

[6]Cairns J,Overbaugh J,Meller S.The origin of mutants[J].Nature,1988,335(6186):142.

[7]何礼贤.社区获得性肺炎诊治指南评价及有关问题[J].中国抗感染杂志,2004,27(4):28.

[8]Niederman MS,Mandell LA,Anzueto A,et al.Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia.Diagnosis,assessment of severity,antimicrobial therapy,and prevention[J].Am J Respir Crit Care Med,200l,163:1730.