155例汉族结核病患者N-乙酰基转移酶2(NAT2)基因多态性分析

李昕洁 王云南 邹永红 何刚 尹小毛 张言斌 苏雯婕 刘志辉

(1.广州市胸科医院 广州 510095;2.广州医学院 广州 510180)

155例汉族结核病患者N-乙酰基转移酶2(NAT2)基因多态性分析

李昕洁1王云南1邹永红1何刚1尹小毛1张言斌1苏雯婕2刘志辉1

(1.广州市胸科医院 广州 510095;2.广州医学院 广州 510180)

目的探讨中国汉族结核病患者N-乙酰基转移酶2(NAT2)基因分布特征>。方法应用PCR-DNA测序技术测定外周血淋巴细胞基因组NAT2基因的特定序列,分析常见位点的单核苷酸突变,并与文献报道的中国其他地区健康人群NAT2基因多态性进行比较>。结果对155例汉族结核病患者NAT2基因的特定序列进行了测定,NAT2等位基因频率分别为：NAT2*4(50.7%),NAT2*5A(0.6%),NAT2*5B(4.8%),NAT2*5C(1.0%),NAT2*6(28.7%),NAT2*7(14.2%);共检测到 NAT2*4/4、NAT2*4/5A 、NAT2*4/5B、NAT2*4/5C、NAT2*4/6、NAT2*4/7、NAT2*5B/6、NAT2*5B/7、NAT2*6/6 、NAT2*6/7、NAT2*7/7 11 种基因型 ,根据基因表型的代谢速度将其分为快型(NAT2*4/4)、中间型(NAT2*4/5A、NAT2*4/5B、NAT2*4/5C 、NAT2*4/6、NAT2*4/7)、慢型(NAT2*5B/6、NAT2*5B/7 、NAT2*6/6 、NAT2*6/7 、NAT2*7/7)3类,出现频率分别为：23.2%,54.9%(1.3%,3.2%,1.9%,34.9%,13.6%),21.9%(1.9%,4.5%,5.8%,9.0%,0.6%);结核病患者与健康人群间的代谢速度分型频率差异有统计学意义(χ2=11.93,P＜0.01)>。结论中国汉族结核病患者NAT2的基因表型以中间型为主要存在形式(占54.9%),NAT2的基因型分布可能与结核病易感性有关。

结核/酶学;芳基胺N-2酰转移酶;多肽现象,遗传;汉族

N-乙酰基转移酶2(NAT2)是体内重要的Ⅱ相代谢酶,直接影响芳香胺及杂环胺类物质在人体内的代谢,研究表明NAT2的基因多态性与某些疾病的遗传易感性相关且存在明显的种族和地域差异。国外已有研究报道南非、俄罗斯等人群中NAT2基因多态性分布与结核病的遗传易感性之间的关系[1-2],然而在我国,对于NAT2基因多态性在结核病患者中的分布规律则未见报道。本研究应用PCR-DNA测序技术对我国结核病患者外周血淋巴细胞基因组NAT2基因的特定序列进行测定,分析常见位点的单核苷酸突变,旨在了解我国结核病患者NAT2基因多态性分布特征,并为进一步研究NAT2基因多态性与结核病易感性、抗结核药物肝损害的关系等提供资料。

1 材料和方法

1.1 研究对象 本院确诊的汉族结核病患者外周血标本155例,其中男性99例,女性56例,年龄17～81岁,平均42.7岁,个体间无亲缘关系。

1.2 仪器与试剂 DNA提取液购自深圳匹基生物工程有限公司;PCR试剂购自美国Promega公司,引物由大连宝生物工程有限公司合成;PCR产物纯化试剂购自天根生化科技有限公司;PCR扩增仪为美国Applied Biosystems公司9600 GeneAmp PCR System;DNA测序仪为美国 ABI 3100基因分析仪。

1.3 NAT2基因型检测

1.3.1 DNA提取 采用密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞后,加入40 μ l DNA提取液,漩涡振荡30 s,于1 680 g离心5 s后100℃水浴10 min;之后以7 280 g离心10 min,吸取上清液置于一新EP管中,-20℃保存备用。

1.3.2 引物设计 根据文献报道的人类NAT2基因序列设计扩增引物,PCR上、下游引物分别为5′-GCTGGGTCTGGAAGCTCCTC-3′和 5′-TTGGGTGATACATACACAAGGGG-3′。

1.3.3 PCR扩增 (1)反应体系：50 μ l反应体系中,4种dNTP的终浓度均为0.2 mmol/L,上下游引物终浓度均为0.8 mmol/L,TaqDNA聚合酶为1.25 U,模板量为50～100 ng。(2)反应条件：95℃预变性3 min,95℃30 s、60℃30 s、72℃1 min共30个循环,72℃延伸5 min。

1.3.4 PCR产物测序及结果分析 PCR产物进行电泳确定其为NAT2后,阳性标本纯化后进行测序分析。(1)测序体系配制：在PCR反应管中依次加入 1 μ l Ready Reaction Premix 、3.5 μ l BigDye Sequencing Buffer、13 μ l去离子水 、0.2 μ l上游引物(浓度为 20 μ mol/L)、0.2 μ l 下游引物(浓度为20 μ mol/L)和 2.5 μ l DNA 模板并混匀。(2)测序反应条件：96℃预变性3 min,96℃10 s、50℃5 s、60℃4 min共25个循环,4℃保存。(3)产物纯化后上测序仪检测,判断测定序列包含的等位基因类型,并判断个体基因型。

2 结果

2.1 我国汉族结核病患者NAT2等位基因频率NAT2*4(50.7%),NAT2*5A(0.6%),NAT2*5B(4.8%),NAT2*5C(1.0%),NAT2*6(28.7%),NAT2*7(14.2%),未检测到NAT2*14型基因突变。(见表1)

表1 我国汉族结核病患者NAT2等位基因分布频度

表2 我国汉族结核病患者NAT2基因型分布

表3 结核病患者与健康人群NAT2基因型分布情况

2.2 NAT2基因代谢速度分型 本次实验共检测到 NAT2*4/4、NAT2*4/5A、NAT2*4/5B、NAT2*4/5C 、NAT2*4/6 、NAT2*4/7 、NAT2*5B/6、NAT2*5B/7、NAT2*6/6、NAT2*6/7、NAT2*7/7 11种基因型,根据基因表型的代谢速度将其分为快型(NAT 2*4/4)、中间型(NAT 2*4/5A 、NAT2*4/5B 、NAT2*4/5C 、NAT2*4/6、NAT2*4/7)、慢型(NAT2*5B/6、NAT2*5B/7、NAT2*6/6 、NAT2*6/7、NAT2*7/7)3 类 ,分别为23.2%、54.9%、21.9%,以中间型为主,而其中又以NAT2*6等位基因出现频率最高,频率分布见表2。

2.3 结核病患者与健康人群NAT2基因型分布情况比较 和文献[3-4]比较,我国汉族结核病患者与健康人群间的代谢速度分型频率差异有统计学意义(χ2=11.93,P ＜0.01)(表3)。由此说明：我国汉族结核病患者与健康人群具有不同的NAT2基因型特征。

3 讨论

人类N-乙酰基转移酶(NATs)在体内催化多种药物和致癌物质的代谢,广泛分布于胃、小肠、结肠和肝脏,因编码基因不同而将其分为 NAT1和NAT2 2个亚类。其中NAT2的基因多态性与某些药物的临床疗效和不良反应的个体差异以及一些疾病的遗传易感性相关[5],研究不同人群或个体的NAT2多态性具有非常重要的意义。

NAT2基因位于人类第8对染色体的短臂2区2带(8p22)上,目前已发现有26种等位基因[6],常见的等位基因突变主要发生在191、282、341、481、590、803、857 7 个位点,其中亚洲人以 481(M1)、590(M2)、857(M3)和191(M4)等位点的基因突变为常见。多态性的NAT2等位基因构成了多态性的NAT2基因型,根据乙酰化代谢能力的不同,NAT2基因表型可分为：快速乙酰化型、中间型、慢乙酰化型。快乙酰化型是野生纯合子型(NAT2*4/4),中间型是野生型和突变型的杂合子型(NAT 2*4/5,NAT2*4/6,NAT2*4/7),而慢乙酰化型是指纯合突变型(含有NAT2*5,NAT2*6,NAT2*7任意2或3个等位基因)。

NAT2基因的多态性具有显著的种族和地区差异,其等位基因突变的发生导致酶活性下降、稳定性降低及表达量减少使得乙酰化代谢能力受损,造成个体对疾病易感性的差异。国外已有报道研究NAT2基因多态性分布与结核病的遗传易感性之间的关系[1-2]：在俄罗斯本土人群中,NAT2的基因多态性与结核病易感性相关,以NAT2*5/5基因型在结核病人中的出现频率显著高于健康对照人群;Adams等[2]研究则显示,南非人群中NAT2快型基因型占有很高比例,可能与南非人群结核病易感性有关。本次研究对155例结核病患者的外周血淋巴细胞NAT2基因多态性进行检测,共检测到NAT2*4/4 、NAT 2*4/5A 、NAT 2*4/5B 、NAT 2*4/5C 、NAT2*4/6、NAT2*4/7 、NAT2*5B/6、NAT2*5B/7 、NAT2*6/6 、NAT2*6/7 、NAT2*7/7共11种基因型,各基因型频率分别为：23.2%、1.3%、3.2%、1.9%、34.8%、13.6%、1.9%、4.5%、5.8%、9.0%、0.6%。其中,中间型(NAT2*4/5A 、NAT2*4/5B 、NAT2*4/5C 、NAT2*4/6、NAT2*4/7)所占比例最大,为54.9%;快速乙酰化型、慢速乙酰化型分别为23.2%,21.9%,说明我国结核病患者NAT2基因表型以中间型最为常见。NAT2各等位基因分布频率为：NAT2*4(50.7%),NAT2*5A(0.6%),NAT2*5B(4.8%),NAT2*5C(1.0%),NAT2*6(28.7%),NAT2*7(14.2%),以NAT2*4出现频率最高,其次为 NAT2*6和 NAT2*7、NAT2*5A 、NAT2*5B、NAT2*5C则出现较少,未检测到NAT2*14型基因突变,我们也注意到在慢速乙酰化型基因表型中,NAT2*6等位基因出现频率最高。同时我们也将结核病患者NAT2基因型分布频率与文献报道[3-4]我国其他地区健康人群NAT2基因型分布频率做比较,2者之间差异有统计学意义(χ2=11.93,P＜0.01),提示我们NAT2基因型分布可能与我国汉族人群结核病易感性相关。在我们的研究中,中间型出现频率最高,且显著高于健康人群,这与国外的一些报道结果不尽相同[1],这可能是由于所在的地域不同,研究人群有所差别所致。

另外,也有文献报道其慢乙酰化型与抗结核药物治疗的肝功能损害发生关联[7]。

综上所述,本研究为我国汉族结核病患者NAT2基因多态性分布特点提供了可靠数据,对研究NAT2基因多态性与抗结核药物肝损害的关系提供了一定的参考价值。同时,本研究结果初步提示NAT2基因多态性与结核病易感性相关,但对其作用机制还不了解,需扩大样本量做进一步的研究。

[1]Gra OA,Kozhekbaeva ZhM,Litvinov VI.Analysis of genetic predisposition to pulmonore tuberculosis in native Russians[J].Genetika,2010,46(2)：262-271.

[2]Adams CH,Werely CJ,Victor TC,Hoal EG,Rossouw G,van Helden PD.Allele frequencies fo r glutathione S-transferase and N-acetyltransferase 2 differ in African population groups and may be associated with oesophageal cancer or tuberculosis incidence[J].Clin Chem Lab Med,2003,41(4)：600-605.

[3]高建平,黄跃东,梁建平,蔡秀珍.福建地区汉族人群 N-乙酰基转移酶基因多态性[J].中国现代医学杂志,2003,13(21)：32-34.

[4]邓刚,张雄信,包其郁.温州地区汉族人群N-乙酰基转移酶2基因多态性分析[J].中国优生与遗传杂志,2006,14(12)：35-36.

[5]Windmill KF,Gaedigk A,Hall PM,Samaratunga H,Grant DM,M cManus ME.Localization of N-acetyltransferases NAT 1 and NAT2 in human tissues[J].T oxicol Sci,2000,54(1)：19-29.

[6]Bell DA,Badawi AF,Lang NP,Ilett KF,Kadlubar FF,Hirvonen A.Polymorphism in the N-acety ltransferase l(NA T1)polyadenylation signal：association of NAT1*10 allele with higher N-acetylation activity in bladder and colon tissue[J].Cancer Res,1995,55(22)：5226-5229.

[7]Huang YS.Genetic polymorphisms of drug-metabolizing enzymes and the susceptibility to antituberculosis drug-induced liver injury[J].Expert Opin Drug M etab T oxicol,2007,3(1)：1-8.

An analysis on N-acetytransferase 2 genetic polymorphisms in 155 Hans Chinese patients with tuberculosis

Li Xinjie1,Wang Y unnan1,Zou Y onghong1,He Gang1,Y in Xiaomao1,Zhang Y anbin1,Su Wenjie2,Liu Zhihui1
(1.Guangzhou Chest Hospital,Guangzhou510095,China;2.Guangzhou Medical College,Guangzhou510180,China)

ObjectiveTo determine the distribution of N-acetyltransferase 2(NAT2)genetic polymorphisms in Chinese Hans TB patients.MethodsT he specific gene sequence of NAT2 from peripheral blood lymphocytes were detected by PCR-DNA sequencing technique and the common sites of single nucleotide polymorphism were analysed.These results were compared with the data of healthy population reported in other articles.ResultsOf 155 Chinese Hans TB patients,the alleles genetic frequencies of NAT2*4,NAT2*5A,NAT2*5B,NAT2*5C,NAT2*6,and NAT2*7 were 50.7%,0.6%,4.8%,1.0%,28.7%and 14.2%respectively.11 genotypes as follow were detected：NAT2*4/4,NAT2*4/5A,NAT2*4/5B,NAT2*4/5C,NAT2*4/6,NAT2*4/7,NAT2*5B/6,NAT2*5B/7,NAT2*6/6,NAT2*6/7 and NAT2*7/7.According to the metabolic phenotype,these genotypes were divided into fast type(NAT2*4/4),interme-diate type(NAT2*4/5A,NAT2*4/5B,NAT2*4/5C,NAT2*4/6,NAT2*4/7)and slow type(NAT2*5B/6,NAT2*5B/7,NAT2*6/6,NAT2*6/7,NAT2*7/7).And their frequencies were 23.2%,54.9%(1.3%,3.2%,1.9%,34.9%,13.6%),and 21.9%(1.9%,4.5%,5.8%,9.0%,0.6%),respectively.There are significant difference in the phenotype distribution between TB patients and healthy population(χ2=11.93,P ＜0.01).ConclusionsThe intermediate type of NAT2 genotype in Chinese Hans TB patients was main form,and NAT2 genotype distribution may be associated with TB susceptibility.

tuberculosis/enzymology;arylamire N-acetyltransferase;polymorphism,genetic;Han nationality

Wang Yunnan(13059192298@wo.com.cn)

王云南(13059192298@wo.com.cn)

广东省科技计划项目(2008B030301265)

2011-03-25)

(本文编辑：范永德)