TGF-β抑制剂Decorin对AngⅡ调节人脐静脉内皮细胞Toll样受体2表达的影响

方 玲 刘先哲 余 旻 鲍荣辉 胡艺琼 朱志林 井 景 刘晓光 李俊明

(宜昌市第一人民医院心内科，湖北 宜昌 443002)

在动脉粥样硬化(AS)发生、发展过程中，活化的Toll样受体2(TLR2)能够促进内膜粥样斑块形成及AS进展〔1，2〕，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)则作用于心血管的特异性受体，通过各种不同途径，最终引起 AS〔3〕，转化生长因子 β(TGF-β)在 AS 过程中则可以延缓AS病变的发展过程，从而发挥保护性作用〔4，5〕。早期实验已经证实AngⅡ能够使细胞TGF-β的表达增加〔6〕，同时TGF-β可调节AngⅡ诱导心室重构〔7〕。近期实验发现TGF-β对不同配体诱导的TLR2表达的调控具有不同的作用〔8，9〕。本课题前期实验已经证实了AngⅡ能够下调体外培养的人脐静脉内皮细胞(HECV)TLR2表达，本文采用 TGF-β的抑制剂Decorin刺激体外培养的HECV，观察TGF-β在AngⅡ对 TLR2表达影响的过程中有何种作用。

1 材料与方法

1.1 材料 HECV-304购自武汉典型培养物保藏中心细胞库;RPMI1640培养基、胰蛋白酶、AngⅡ购自Sigma公司;Decorin购自R＆D公司;胎牛血清购自杭州四季青生物技术有限公司;Trizol试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司;实时定量PCR各种试剂均购自Promega;DNA Maker购自TaKaRa公司;Western及免疫沉淀(IP)细胞裂解液购自碧云天生物技术研究所;TLR2一抗、二抗购自R＆D公司;蛋白Marker购自Fermentas公司;DAB试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HECV-304的传代培养及分组收到定购的细胞后先将培养瓶内的培养液在超净工作台内用吸管全部吸出，置于另一无菌容器，再向培养瓶中加入1 ml胰蛋白酶，37℃消化直到细胞脱落，换新的培养瓶，加入吸出的培养液5 ml，在37℃，5%CO2培养箱培养，当细胞生长到90%以上单层融合状态时，即可加入胰蛋白酶进行消化，按1∶2进行传代培养。细胞分为①正常对照组:取2瓶处于对数生长期的HECV-304细胞进行1∶2传代(传代后调节细胞浓度为104/ml，每瓶接种细胞悬液5 ml)，待细胞贴壁后(约传代后4 h)每瓶细胞分别加入高压灭菌的PBS溶液100μl，培养20 h后每瓶细胞内加入高压灭菌的三蒸水500μl，继续培养1 h。②AngⅡ刺激组:取2瓶处于对数生长期的HECV-304细胞进行1∶2传代(传代后调节细胞浓度为104/ml，每瓶接种细胞悬液5 ml)，恒温培养24 h后每瓶细胞分别加入 10-4、10-5、10-6、10-7mol/L 的 AngⅡ溶液 500 μl，继续培养1 h。测定各组细胞TLR2蛋白及基因的表达量。②AngⅡ+Decorin刺激组:取2瓶处于对数生长期的HECV-304细胞进行1∶2传代(传代后调节细胞浓度为104/ml，每瓶接种细胞悬液5 ml)，待细胞贴壁后(约传代后4 h)每瓶细胞分别加入80、40、20、10 μg/ml的 Decorin溶液100 μl，培养20 h后每瓶细胞内加入10-5mol/L的AngⅡ溶液500μl，继续培养1 h。

1.2.2 实时定量PCR各组细胞按照上述分组方法处理后收集并提取总RNA 采用Trizol试剂一步法抽提，并对抽提的RNA用1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，以确定RNA的纯度及完整性。实时定量PCR采用两步法:各组RNA定量2μg、5×逆转录缓冲液4μl、100 mmol/L二硫代苏糖醇(DTT)1μl、100 μmol/L Oligo(dT15)1 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl加 DEPC 处理水至总体积为18μl，稍离心65℃温育5 min后置于冰上，加入逆转录酶(MMLV)逆转录酶(100 U/μl)2 μl，37℃ 逆转录60 min，94℃ 5 min灭活逆转录酶。PCR反应体系:0.5 mmol/L dNTP 1 μl、10 × PCR 缓冲液 2 μl、25 mmol/L MgCl22 μl、2.5 U/μl Taq DNA 聚合酶 0.4 μl、灭菌三蒸水 9.6 μl、反转录产物2μl、4μmol/L上游引物 1 μl、4 μmol/L下游引物 1 μl、Taqma探针1μl。PCR反应条件为:预变性94℃ 3 min、变性95℃10 min 1个循环，退火95℃ 15 s、延伸56℃ 1 min 40个循环。TLR2上游引物序列:5'-CTACTGGGTGGAGAACCTTATGGT-3'，TLR2下游引物序列:5'-CCGCTTATGAAGACACAACTTGA-3'，cDNA 长度77 bp，TLR2 探针序列:5'-CAGGAGCTGGAGAACTTCAATCCCCC-3';GAPDH上游引物序列:5'-GAAG-GTGAAGGTCGGAGTC-3'，GAPDH下游引物序列:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，cDNA 长度225 bp，GAPDH 探针序列:5'-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3'。PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳(90 V，20 min)，Gene Genius凝胶分析系统成像。

1.2.3 Western印迹 各组细胞按照上述分组方法处理后采用Western及IP细胞裂解液一步法，收集并制备蛋白样品。各取含蛋白样品50μg的提取液，以浓缩胶体积分数为4%，分离胶体积分数为10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶120 V，分离胶80 V，电泳4～5 h分离。电泳完毕后用半干电转移槽转移至硝酸纤维素膜上(60 V转移2 h)，在室温下用封闭液(5%脱脂奶粉，0.05%Tween20，TBS)封闭1 h。然后依次与 TLR2的一抗、二抗在室温下孵育1～2 h，DAB显色并照相。

1.3 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件进行分析，数据资料以±s表示，单因素方差分析。

2 结果

2.1 TGF-β抑制剂 Decorin减弱 AngⅡ对体外培养 HECV TLR2蛋白表达的下调作用 以β-actin为内参照，在加入相同量蛋白样品的情况下，AngⅡ+Decorin刺激组TLR2蛋白的表达量明显高于AngⅡ刺激组。见图1、图2。

2.2 TGF-β抑制剂 Decorin减弱 AngⅡ对体外培养 HECV TLR2基因表达的下调作用 GAPDH为内参照，在加入相同量RNA的情况下，AngⅡ+Decorin刺激组TLR2基因的表达量明显高于AngⅡ刺激组，与正常对照组相比差异有统计学意义(0.864 0)，在没有Decorin刺激时TLR2基因的表达量明显降低(0.000 2)，10μg/ml Decorin刺激后TLR2基因的表达有所升高(0.005 6)，并随 Decorin浓度增大表达升高越明显，80μg/ml Decorin刺激后 TLR2基因的表达升至最高(0.381 2)，差异有统计学意义。见表1，图3。

表1 TGF-β抑制剂Decorin在AngⅡ对TLR2基因调控中的影响(±s)

表1 TGF-β抑制剂Decorin在AngⅡ对TLR2基因调控中的影响(±s)

与10-5 mol/L AngⅡ组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;CT值为RT-PCR后得出的各基因的相对表达量，根据公式△CT=CTTimeX-CTTime0计算出2-△△CT，然后进行统计分析;目的基因CT代表TLR2基因的相对表达量;内参基因CT代表管家基因GADPH的相对表达量

组别 目的基因CT 内参基因CT 2-△△CT 20.697 3±0.275 0 7.082 3±0.363 9 0.000 2 10μg/mlDecorin+10-5 mol/L AngⅡ组 18.349 7±0.350 4 9.095 7±0.287 3 0.005 61)20μg/mlDecorin+10-5 mol/L AngⅡ组 22.683 7±0.278 2 16.598 0±0.230 5 0.028 92)40μg/mlDecorin+10-5 mol/L AngⅡ组 21.222 7±0.173 1 16.826 7±0.210 6 0.093 22)80μg/mlDecorin+10-5 mol/L AngⅡ组 9.842 3±0.139 3 7.478 3±0.171 2 0.381 22)10-5 mol/L AngⅡ组

图1 AngⅡ+Decorin刺激组TLR2蛋白表达

图2 AngⅡ刺激组TLR2蛋白表达

图3 实时定量PCR产物电泳图

3 讨论

AS的炎症浸润通常存在于动脉壁的内膜层和外膜层，作为动脉内膜的最主要组成细胞，已经证实了内皮细胞在动物模型中参与了内膜的损伤，AngⅡ以自分泌或旁分泌的方式作用于循环系统的特异性受体，从而影响血流动力学，引起内皮细胞功能紊乱和动脉炎症的发生，并最终导致AS的发生〔10〕。同时越来越多的证据表明血管内皮细胞表达的TLR2能够通过不同的途径引起促炎细胞因子与趋化因子的大量释放，导致炎症细胞的活化、血管平滑肌细胞(VSMC)的迁移和增殖、单核细胞的募集，促进内膜粥样斑块的形成。另外，TGF-β在AS过程中通过抑制VSMC的迁移、促进ECM的形成、抑制血管内皮促炎黏附分子的表达以及减少体外培养巨噬细胞泡沫细胞的形成等作用延缓AS病变的发展过程，从而发挥保护性作用。已经有研究证实TGF-β对不同配体引起的体内外TLR2的表达具有不同的影响作用，但TGF-β抑制剂Decorin在AngⅡ对TLR2表达调控中的作用还没有研究过。本实验发现 TGF-β抑制剂Decorin减弱了AngⅡ对TLR2蛋白及基因表达的下调作用，并且随着其浓度的增加加强作用越强，但另一方面，还必须弄清楚TGF-β本身对TLR2的表达具有什么影响，这样才能更加准确地知道TGF-β的作用到底是通过AngⅡ或其他因子实现的还是直接影响了TLR2，同时在实验中选取的Decorin浓度有限，只有4个不同浓度，无法预知在其浓度更大或更小时对TLR2的表达有没有影响，影响与目前的实验结果是否一致，目前关于TGF-β-AngⅡ-TLR2之间调节的具体机制和信号通路还十分模糊，还需要通过进一步的实验来证实。

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