姜黄素对人鼻咽癌CNE-2Z细胞侵袭和转移的体外实验研究

范德生 李泽民 孙宁

1.上海中医药大学附属曙光医院病理科，上海 200021；2.广东医学院病理学教研室，广东 东莞 523808

姜黄素对人鼻咽癌CNE-2Z细胞侵袭和转移的体外实验研究

范德生1李泽民1孙宁2

1.上海中医药大学附属曙光医院病理科，上海 200021；2.广东医学院病理学教研室，广东 东莞 523808

背景与目的：鼻咽癌放射治疗后的局部复发和远处转移是患者死亡的主要原因之一。姜黄素(curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄(Curcuma longa)根茎中提取的一种酚性色素，具有抗菌、抗肿瘤及抗氧化作用。本研究旨在探讨姜黄素对人鼻咽癌CNE-2Z细胞侵袭和转移的影响，并探讨其可能的机制。方法：以10、20、40和80 μmol/L姜黄素分别处理CNE-2Z细胞24、48 h后，MTT法检测其对细胞的生长抑制作用。应用Transwell小室进行人工重组基底膜(matrigel)侵袭和运动实验，观察姜黄素对CNE-2Z细胞侵袭和转移的影响。RT-PCR和Western blot分别检测不同浓度姜黄素作用后细胞中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)表达水平的变化。结果：应用姜黄素处理后，人鼻咽癌CNE-2Z细胞生长受到抑制，且作用呈时效-量效依赖关系；同时细胞侵袭和迁移能力明显降低；EGFR基因和蛋白表达亦明显减弱。结论：姜黄素能够减弱人鼻咽癌CNE-2Z细胞的体外侵袭和转移能力，其机制可能与降低EGFR的表达有关。

鼻咽癌； 姜黄素； 侵袭； 转移

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)多发于广东珠江三角洲地区及两广西江流域，俗称“广东瘤”。鼻咽癌生长位置深并有重要神经血管相邻，不易发现且不易手术切除。90%左右的鼻咽癌为未分化型非角化性癌，对放射线杀伤较敏感，因而放射治疗是鼻咽癌首选治疗手段，但仍有40%～60%鼻咽癌患者死于鼻咽或颈部复发和(或)远处器官转移。姜黄素(curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄(Curcuma longa)根茎中提取的一种酚性色素，具有抗肿瘤［1］、抗氧化［2］、抗炎［3］、抑制血管生成［4］及调节多药耐药基因［5］的作用。近年来，有研究证实姜黄素能够减少肿瘤细胞体内及体外的侵袭和转移［6-7］。本研究观察了姜黄素对人鼻咽癌CNE-2Z细胞侵袭转移能力的影响，并通过检测与侵袭转移密切相关的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)表达的变化，探讨姜黄素影响鼻咽癌细胞侵袭转移的可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人低分化鼻咽癌细胞系CNE-2Z细胞由广东医学院病理学教研室分离并保存。其他药品和试剂包括：姜黄素(绿天公司，杭州)，RPMI-1640培养液(Gibco，美国)，新生小牛血清(四季青生物材料工程公司，杭州)，四甲基偶氮唑蓝(MTT) (Sigma，美国)，细胞总RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒(Tiangen公司，北京)，鼠抗人EGFR单克隆抗体(Santa Cruz，美国)，兔抗人β-actin多克隆抗体，HRP标记羊抗鼠IgG (H+L)(中杉生物技术有限公司，北京)，人工重组基底膜Matrigel胶(Sigma，美国)，Tanswell Chamber (8 μm孔径，Costar，美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

CNE-2Z细胞置于RPMI-1640培养液中(含10%新生小牛血清，青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL，0.056% NaHCO3，调节pH值至7.4)，于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱内常规培养，0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 姜黄素对细胞增殖的抑制作用

取对数生长期细胞，调整到所需细胞浓度，接种于96孔培养板(每孔150 μL)，按不同实验设计将培养液换成空白对照液和不同浓度的姜黄素溶液(10、20、40及80 μmol/L)，分别培养24 h或48 h。

每孔加入MTT 50 μL (浓度为5 mg/mL)，于37 ℃培养箱内温育4 h后终止。吸弃各培养孔内上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，震荡摇匀后在全自动酶标仪上波长490 nm处测各孔吸光度(D)值，不同浓度的姜黄素对肿瘤细胞增殖的毒性以抑制率，计算公式为：细胞抑制率(%)=(D对照组-D实验组)/D对照组×100%。

1.2.3 细胞体外侵袭实验

取指数生长期的各组不同浓度姜黄素处理的细胞，Trypsin-EDTA消化制备细胞悬液，台盼蓝染色做活细胞计数，用RPMI-1640(含1%小牛血清)洗涤1次，然后用RPMI-1640 (含1%小牛血清)稀释制备5.0×105mL-1的细胞悬液。Matrigel®置于冰上放置8 h，用预冷至0 ℃的无菌三蒸水稀释Matrigel®至200 μg/mL。稀释后的Matrigel®每孔按50 μL铺入Transwell®上室，置于超净工作台过夜风干。临用前在Transwell®上室中加入无血清RPMI-1640培养液每孔100 μL，预温至37 ℃，室温100 r/min振摇90 min后，吸去液体以去除未结合的Matrigel®。细胞悬液按每孔100 μL加入Transwell®，每组2孔；Transwell®下室加入RPMI-1640 (含10 μg/mL Fibronectin、10%小牛血清)600 μL。弃去孔内培养液，加入甲醇和丙酮(1∶1)固定10 min。以PBS浸湿的棉签拭去聚碳酸酯滤膜正面(靠近上室面)的细胞。苏木精染色3 min，水洗，伊红染色10 s，水洗，中性树胶封片。于200倍显微镜下计数穿过PVPF滤膜的细胞数。每膜计数上、下、左、右、中5个随机不同视野，以每视野细胞平均数代表侵袭能力，每组平行设3个滤膜。

1.2.4 细胞运动实验

细胞运动实验中Transwell®上室的聚碳酸酯滤膜不铺设Matrigel®，其余步骤与细胞侵袭实验相同，实验重复3次。

1.2.5 RT-PCR检测

收集不同浓度姜黄素(0、10、20和40 μmol/L)作用细胞24 h，使用细胞总RNA提取试剂盒提取培养细胞总RNA，采用一步法进行RT-PCR反应，以GAPDH为内参照。参照GenBank数据库，采用Oligo计算机软件设计引物，由上海生工生物技术公司合成。E G F R上游引物：5’-GTGGCTGGTTATGTCCTCA-3’， 下游引物：5’-CAGTTTCTGGCAGTTCTCCT-3’，扩增产物3 7 7 b p；G A P D H上游引物：5’-GCATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物：5’-TGGGTGAGGAGGTGGAAA-3’，扩增产物858 bp；反应条件：50 ℃逆转录30 min，94 ℃逆转录失活5 min，然后94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR产物加入1 μL的6×Loading Buffer，进行1%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 μg/mL的EB)，电泳缓冲液为1×TAE，在50 V电压下电泳30 min，紫外灯下观察结果。凝胶成像系统摄像并分析，以EGFR与GAPDH扩增条带的峰面积比值进行mRNA水平的相对定量。

1.2.6 Western blot 分析

用预冷的PBS洗细胞2次，然后加细胞裂解液冰上放置20 min，4 ℃，12 000 r/min离心20 min，收集上清液定量分析。取已定量的总蛋白进行12% SDS-PAGE实验，电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜，加入1∶500稀释的鼠抗人EGFR单克隆抗体，室温温育3 h，TBS洗涤后加入稀释度1∶4 000的HRP标记羊抗鼠IgG(H+L)，室温温育90 min；TBS洗涤后经化学发光试剂温育，暗室X片曝光显示实验结果。

1.2.7 统计学处理

实验数据用表示，实验结果选用单因素方差分析，数据资料采用统计学软件SPSS 12.0处理。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度姜黄素对CNE-2Z细胞增殖的影响

不同浓度姜黄素可以不同程度地抑制细胞增殖，同一时间点各实验组细胞抑制率相比较差异有统计学意义，且抑制率与姜黄素浓度呈明显的剂量效应关系(图1)。同时在40、80 μmo/L姜黄素作用细胞24 h后，在倒置显微镜下观察到细胞轮廓模糊，细胞质空泡和颗粒增多，不规则细胞增多，并见大量细胞脱落，培养液中出现很多的悬浮细胞碎片，表明高浓度姜黄素不仅抑制细胞的增殖，还可能有细胞毒作用，可以直接杀伤CNE-2Z细胞。

2.2 姜黄素对CNE-2Z细胞侵袭、运动能力的影响

Transwell体外侵袭和运动实验，以24 h穿过人工重组基底膜到达聚碳酸酯滤膜的细胞数表示细胞侵袭和运动能力的大小。结果显示姜黄素能抑制CNE-2Z细胞的侵袭、运动能力，与未加姜黄素的对照组细胞数比较，差异具有统计学意义(P＜0.001，表1)。

表 1 不同浓度姜黄素对CNE-2Z细胞侵袭和运动能力的影响Tab. 1 Effect of different concentrations of curcumin on invasion and migration of CNE-2Z cells(n, ±s)

表 1 不同浓度姜黄素对CNE-2Z细胞侵袭和运动能力的影响Tab. 1 Effect of different concentrations of curcumin on invasion and migration of CNE-2Z cells(n, ±s)

*: Compared with the control group, P＜0.001(P=0.000, respectively).

Curcumin concentration/μmol·L−1 Invasion Migration 0 (control) 67.67±7.234 95.67±2.309 10 54.33±4.041* 82.00±6.000*20 46.00±4.000* 65.69±5.686*40 34.67±3.786* 60.64±2.082*

2.3 姜黄素对CNE-2Z细胞EGFR mRNA及蛋白表达的影响

本实验RT-PCR结果显示，各组细胞均有EGFR mRNA的表达，扩增电泳带约在377 bp处，对其进行光密度扫描半定量分析结果显示，CNE-2Z细胞在不同浓度姜黄素处理24 h后，EGFR mRNA的表达有不同程度的减少，随姜黄素浓度的升高呈现逐渐降低的趋势，各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.001，图2)。Western blot结果显示，不同浓度姜黄素处理细胞24 h后，EGFR蛋白的表达亦有不同程度的减少(图3)。

3 讨 论

近年来，植物来源的药物越来越受到重视，从天然植物中寻找高效、低毒的抗肿瘤新药，是肿瘤治疗研究领域中的重要课题。Kuttan等［8］通过对姜黄提取物和姜黄素的研究发现，姜黄素能明显抑制CHO细胞的生长，具有抗肿瘤特性。许多体内外实验已经证实，姜黄素具有确切的抗肿瘤活性［9-10］。本实验观察到，在10～80 μmol/L浓度范围内，姜黄素在作用24 h和48 h后均可抑制CNE-2Z细胞的增殖，且随浓度的增加其抑制率呈现增长的趋势，同一时间点各实验组细胞抑制率相比较，差异有统计学意义。

浸润和转移是恶性肿瘤最基本和最重要的生物学特性之一，肿瘤转移是一个多步骤、多阶段、多基因参与的复杂过程， 从分子水平可将这个过程分为三步，即黏附、降解、运动。因此，具有抗黏附、抗运动或抗侵袭降解作用的化合物均可抑制恶性细胞的转移行为。1995年，Menon等［11］报道姜黄素可抑制高转移鼠黑色素瘤细胞B16 F10在小鼠体内的肺转移，使肺脏肿瘤结节明显减少，生存期延长。2001年，沈晓鸣等［12］证实姜黄素对人肺癌细胞的体外侵袭、运动能力有抑制作用。本实验以CNE-2Z细胞为观察对象，获得了姜黄素对CNE-2Z细胞株侵袭、运动影响的较为直接的证据。

表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是一种小分子多肽，EGF作为一种配体与细胞膜上的EGFR结合，改变受体的三维构象，使之二聚体化，进而可激活众多的下游信号路径，包括PLCC、PI3K、小G蛋白、P21ras、rasGTP酶激活蛋白(GAP)、生长因子受体结合蛋白2 (grb2) 和src激酶家族等，其中研究较明确的主要有两条途径：一条是ras-raf-MEK-erk/MAPK途径；另一条是PI3K-PKCIKK途径，使IJBA磷酸化后导致NFJB移位至核内，而将信息传递入核，该途径与细胞移动性的增强有关。研究发现，MAPK途径在癌细胞移动过程早期起作用，PKC途径在癌细胞移动过程晚期起作用，EGFR的过表达能通过激活PKC途径来补偿MAPK途径的损失，从而在肿瘤的侵袭和转移中起重要作用。

EGFR是EGF的唯一受体，越来越多的研究证实EGFR的高表达与细胞恶变、肿瘤的增殖、转移和肿瘤血管形成等相关。姚运红等［13］研究发现，不同转移能力及途径的肿瘤细胞的EGFR表达不一，但同一转移能力和途径的肿瘤细胞EGFR的表达存在一致性，说明EGFR表达强弱能反映肿瘤细胞的转移能力，并提示在同一肿瘤细胞群体中，可能存在某些既能控制肿瘤生长，又能控制肿瘤转移的同源基因。但目前对EGFR过量表达增强肿瘤转移的机理还了解甚少。曾方银等［14］研究发现肿瘤细胞中EGFR过量表达增强了肿瘤细胞对胞外基质的黏附作用，从而促进了肿瘤细胞分解基底膜和远端转移。肌动蛋白(actin)修饰蛋白的动员是EGFR介导的迁移反应所必需的，EGF与EGFR 结合后，可以激活细胞骨架，通过对细胞骨架重构、黏附、移动、表达和蛋白酶的的活化等多种途径影响肿瘤的转移性［15］。

多种不同的EGFR信号传递抑制剂，如：IMC C225、ZD1839和OSI2774在体内外实验均显示了抗癌活性，并在初步的临床试验中取得了令人振奋的结果。以EGFR为靶点的抗肿瘤治疗有特异、广谱、高效的特点，已成为癌症治疗的成功领域之一。本实结果显示：CNE-2Z细胞在不同浓度姜黄素处理24 h后EGFR mRNA和蛋白的表达均有不同程度的减少，随着姜黄素浓度的升高呈现逐渐降低的趋势。这表明姜黄素有可能通过抑制EGFR的表达来抑制CNE-2Z细胞的增殖和侵袭转移。

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Effects of curcumin on invasion and metastasis of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells

FAN De-sheng, LI Ze-min, SUN Ning(Department of Pathology, Shuguang Hospital,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200021, China)

SUN Ning E-mail：hellen4099@126.com

Background and purpose：The main causes of nasopharyngeal carcinoma patient’s death are loco-regional recurrence and distant metastasis after radiation therapy. Curcumin, a natural compound extracted from rhizomes of curcuma species, has been shown to possess potent anti-inflammatory, anti-tumor and anti-oxidative properties. This study aimed to explore the effects of curcumin on invasion and metastasis of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells and to investigate the possible mechanism.Methods：CNE-2Z cells were treated with 10, 20,40 and 80 μmol/L curcumin for 24 and 48 h, respectively. Proliferation of cells was measured by MTT assay. Invasion and metastasis of cells were evaluated with Transwell chamber. The expression of epidermal growth factor receptor(EGFR) was detected by RT-PCR and Western blot.Results：After being treated with curcumin, the proliferation of CNE-2Z cells was inhibited in a time and dose-depending manner, the invasion and metastasis of cells were also inhibited, and the expression level of EGFR was decreased.Conclusion：Curcumin could decrease the invasion and metastasis of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells possibly by inhibiting the expression of EGFR.

Nasopharyngeal carcinoma; Curcumin; Invasion; Metastasis

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.06.006

R739.63

A

1007-3639(2011)06-0452-05

广东省教育厅自然科学研究项目(No：GK0404)。

孙宁 E-mail:hellen4099@126.com

2011-01-12

2011-05-20）