消银解毒饮调控银屑病血热证肿瘤坏死因子-α的相关研究

夏梦，段行武，高永红，张润田，郝峰

（北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，临床以各种形态的红斑鳞屑为特征，其病理特点是表皮角质形成细胞的过度增殖、分化不全以及真皮毛细血管的增生。目前许多学者认为银屑病是一种多基因遗传背景下的T细胞性的自身免疫性疾病[1]，发病机制的关键是T细胞活化，由活化T细胞产生的淋巴因子刺激表皮增殖，而增殖角质形成细胞又释放其他细胞因子增强活化T细胞作用，形成T细胞介导的恶性循环。

消银解毒饮为我院院内制剂，在临床已应用了二十余年，临床疗效满意[2]，为揭示其对银屑病的调控作用机制，本研究拟以人HaCat细胞和人外周血单一核细胞（PBMCs）为研究对象；用四唑盐比色法观察消银解毒饮及其拆方后两组药物（解毒方和凉血方）血清对其增殖的影响；用双抗体夹心法测定药物对混合培养细胞分泌细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响。研究该方治疗银屑病的细胞分子机制，为中药辨证组方治疗银屑病提供临床依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人永生化角质形成细胞株HaCat细胞，引自中国武汉大学，中国典型培养物保藏中心。

1.1.2 人PBMCs来源 银屑病血热证患者PBMCs来自2009年7月—2010年3月东直门医院皮肤科门诊银屑病初诊患者，共20例，其中男11例，女9例，年龄最大57岁，最小26岁，年龄均45.6岁；病程最长10年，最短3个月，平均病程5.6年。

1.1．3 研究对象的确定

1.1.3.1 诊断标准 根据文献[3]诊断标准.，年龄在18～65岁的银屑病患者。纳入标准：1个月内无任何发热史；3个月内未接受任何系统治疗，如糖皮质激素、维A酸类和免疫抑制剂等；3个月内未大面积外用强效糖皮质激素类药物。

1.1.3.2 辨证标准 根据文献[4]辨证标准，皮疹不断增多，颜色鲜红，层层脱屑，有点状出血现象；伴有口干舌燥，咽喉疼痛，心烦易怒，大便干燥，小便赤黄；舌质红，苔薄黄，脉滑或数。

1.1.3.3 排除标准 不符合诊断标准，不符合血热证辨证标准；合并有其他重要脏器疾病者；妊娠或哺乳期妇女、精神病患者等。

1.1.4 实验动物 SD大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，在北京中医药大学东直门医院三级动物实验室屏障使用环境中进行实验。

1.1.5 试剂 四唑盐(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)，Amresco公司；TNF-α-Elisa试剂盒,Raybiotech公司；阳性对照药甲氨蝶呤（MTX），上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂。

1.2 方法

1.2.1 中药提取液的制备 消银解毒饮、凉血方、解毒方浓缩液均由东直门医院药理实验室加工完成。消银解毒饮为每mL含3g生药；凉血方为每mL含1.35g生药；解毒方为每mL含2.1g生药。

1.2.2 动物药物血清制备 取50只清洁大鼠随机分为5组，消银解毒饮组、凉血方组、解毒方组、甲氨蝶呤（MTX）阳性对照组及蒸馏水空白对照组，每组10只。3个中药组分别给予相应的中药提取液灌胃（按照人和动物体表面积折算成人2倍的剂量），用量分别为消银解毒饮22.5g（/kg·d），凉血方10.125g（/kg·d）；解毒方15.75g（/kg·d）；MTX组以蒸馏水溶解液灌胃，用量为0.45mg/(kg·d)；蒸馏水组给予等量蒸馏水灌饲，2次/d，连续7d后，腹主动脉取血，分离血清，灭活分装备用。

1.2.3 人PBMCs的分离、培养 PBMCs即外周血中具有单一核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。分离方法为Ficoll-Hypaque（葡聚糖－泛影葡氨）密度梯度离心法。

1.2.4 人HaCat细胞与人PBMCs混合接种及培养 以完全培养液将对数生长期的人永生化角质形成细胞株HaCat细胞调成5×107/L，接种于96孔培养板，每孔100μL，再以每孔7 000个加入银屑病血热证患者PBMCs，采用含10%胎牛血清,100U/mL的青、链霉素的MEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱混合培养。

1.2.5 四唑盐（MTT）比色实验测定角质形成细胞增殖率 混合培养细胞24h后，显微镜下观察细胞生长良好，小心配平，1 000r/min离心5min，吸去旧培养液，每孔分别加入体积分数为2.5%、5%、7.5%的药理血清100μL（每组设9个复孔），并设蒸馏水组为空白对照组，MTX组为阳性对照组，置于37℃、5%CO2培养箱混合培养48h后，吸弃孔内液体，每孔加入无血清MEM 100μL和 5g/L的 MTT 20μL，继续培养4h后，吸弃孔内液体，每孔加入DMSO 150μL，震荡10min，待结晶物充分溶解，用酶标仪检测492nm处的吸光度值（A值）。

1.2.6 双抗体夹心法测定细胞培养上清TNF-α含量 取混合培养HaCat细胞与PBMCs细胞48h细胞上清液，采用双抗体夹心法，严格按照说明书操作。

1.3 统计方法 分析组间差别，结果以x±s表示，SPSS 16．0软件统计分析软件One-Way ANVOVA过程进行方差分析，P<0.05表示差别有统计学意义。

2 结果

2.1 药物对人永生化角质细胞增殖的影响 消银解毒饮能抑制银屑病血热证患者角质形成细胞的增殖，，当浓度达到5%时有极其显著性差异，与生理盐水组比较有统计学意义（P<0.001），药理血清的体积与角质细胞增殖呈负相关。消银解毒饮组疗效优于其他两组中药，有统计学意义（P<0.05）。结果见表1（用细胞存活率%来表示）。

细胞存活率（%）=不同动物药物血清组A值/蒸馏水组A值×100%。

2.2 细胞形态学观察 在混合细胞培养板中加入药理血清作用48 h后，药理血清各剂量组在光镜下均可观察到其中的贴壁细胞HaCat细胞的生长受到不同程度的抑制，单位面积数目减少、细胞变圆、变小、漂浮。

2.3 药物对混合细胞上清TNF-α的影响 消银解毒饮能抑制分泌细胞因子TNF-α，与蒸馏水组比较有统计学意义（P<0.05）。且消银解毒方效果优于凉血方、解毒方两组，有统计学差异（P<0.05）。见表2。

表1 不同体积分数药理血清对角质细胞生长增殖的影响（±s）

表1 不同体积分数药理血清对角质细胞生长增殖的影响（±s）

注：各组与蒸馏水组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；凉血方、解毒方与消银解毒方相比，☆P<0.05。

2.5%药理血清 5%药理血清 7.5%药理血清n 66666组别蒸馏水组凉血方组解毒方组消银解毒组甲氨蝶呤组FP A值0.512±0.023 0.438±0.030*☆0.418±0.035**☆0.416±0.038**0.403±0.007**6.886 0.006细胞存活率(%)100 85.4±2.0 81.6±2.6 81.3±6.7 78.7±2.4 A值0.517±0.009 0.434±0.003***☆0.410±0.037***☆0.408±0.04***0.375±0.006***25.846 0.000细胞存活率(%)100 83.9±0.1 79.3±5.6 78.9±0.2 72.5±0.1 A值0.539±0.028 0.433±0.007***☆0.408±0.006***☆0.392±0.031***0.368±0.019***32.339 0.000细胞存活率(%)100 80.3±2.8 75.7±0.5 72.7±2.7 68.3±0.12

表2 不同体积分数药理血清对混合细胞培养上清TNF-α的影响（±s）

表2 不同体积分数药理血清对混合细胞培养上清TNF-α的影响（±s）

注：各组与蒸馏水组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；凉血方、解毒方与消银解毒饮相比，☆P<0.05。

TNF-α n 66666组别蒸馏水组凉血方组解毒方组消银解毒组甲氨蝶呤组FP 5%药理血清13.716±4.355 11.639±1.244 9.563±3.110 7.083±3.730*4.909±2.432*2.936 0.076 7%药理血清22.440±4.940 10.336±3.384**☆9.621±3.390**☆5.306±4.432***4.524±3.889***14.742 0.000 2.5%药理血清13.300±4.355 11.636±0.620 8.737±2.490 7.91±4.970 4.492±1.857*3.005 0.072

3 讨论

银屑病是一种炎症增生性皮肤病，皮损的真皮层有活化的T细胞浸润，这些T细胞可以通过多种途径与表皮细胞产生相互作用，如分泌细胞因子、激活表皮细胞的增殖及凋亡通道，影响环核苷酸及酶学的水平等。真皮层浸润的T细胞诱导表皮细胞合成TNF-α等细胞因子，吸引中性粒细胞在表皮浸润，导致真皮血管扩张，引起皮肤炎症[5]。

目前银屑病的发病机制虽然尚未完全明了，但在银屑病的发病机制中起核心作用的是T淋巴细胞的免疫异常和某些细胞因子的释放，许多具有多种免疫学活性的细胞因子如TNF-α、干扰素（IFN）-γ等参与银屑病病理相关的免疫过程，引起T淋巴细胞和中性粒细胞的活化及趋化。TNF-α主要由活化的单核/巨噬细胞产生，能杀伤和抑制肿瘤细胞，促进中性粒细胞吞噬，抗感染，引起发热，促进细胞增殖和分化是重要的炎症因子，并参与某些自身免疫病的病理损伤。银屑病患者血清中TNF-α呈高水平表达，受TNF-α刺激后T细胞的增生活性及分泌白介素（IL）-8的活性显著增强，提示T细胞在外周血中已处于明显活化状态[6]。TNF-α通过活化T细胞，增强T细胞浸润及增加银屑病皮损中角质形成细胞增生来影响银屑病发病[7]，银屑病患者外周血淋巴细胞具有促进自身角质形成细胞生长的作用[8]，导致角质形成细胞过度增殖。

中医对银屑病的病因病机的认识以围绕血热、血瘀、血燥、血虚的学说为主，认为血热是银屑病的主要原因，因此清热凉血是治疗银屑病的基本方法。全方由水牛角、牡丹皮、赤芍、生甘草、白鲜皮、苦参等组成，方中水牛角凉血解毒为君药；牡丹皮、赤芍等加强凉血解毒之力为臣药；白鲜皮、苦参等祛风除湿为佐药；甘草解毒调和诸药为使药；全方共起凉血解毒、祛风除湿之功效。凉血方和解毒方均为消银解毒饮的拆方中药组，其中凉血方以凉血类中药为主，解毒方以解毒类中药为主。瞿幸[2]用消银解毒饮治疗银屑病血热证85例，疗程8周，总有效率91.8%；对照组30例服用复方青黛胶囊，总有效率80%。治疗组明显优于对照组。

本实验结果证实，消银解毒饮可以抑制人永生化角质形成细胞的活化增殖，当浓度达到5%时有极其显著性差异（P＜0.001），也可以抑制人混合细胞分泌细胞因子TNF-α（P<0.05），且效果优于其他两组拆方中药组。因此，消银解毒饮能够有效的治疗血热证型银屑病，中药凉血类药物与解毒类药物均对血热证型银屑病有治疗效果，但两组药物的协同作用可使治疗效果加倍。因此我们推理消银解毒饮可能是通过抑制银屑病某些细胞因子TNF-α来抑制T细胞活化，由此调控活化T细胞产生的某些淋巴因子来抑制表皮增殖，而抑制增殖角质形成细胞又可以反过来调控释放某些细胞因子来减弱活化T细胞的作用，从而打破T细胞介导的恶性循环来达到抑制角质细胞过度增殖和活化的作用。

本课题通过体外细胞培养的方法研究了中药复方对银屑病角质细胞过度增殖和混合细胞分泌细胞因子TNF-α的影响，为临床运用消银解毒饮治疗银屑病和中药对银屑病发挥治疗作用机理提供了一定的理论依据。

［1］ Ksatelan M,Massari LP,Pasic A,et al.New trends in the immunopathogenesis of psoriasis[J].Acta Dermatovenerol Croat,2004,12:26-29.

［2］ 瞿幸，张晓红，刘铭，等.消银解毒饮治疗银屑病血热证85例临床研究[J].中医志，2001，42(2):103.

［3］ 赵辨.临床皮肤病学[M].第3版.南京:江苏科学技术出版社,2001:759-772．

［4］ 李曰庆.中医外科学[M].第7版.北京:中国中医药出版社，2007:184-185.

［5］ 刘瑞风，张开明.T细胞皮肤归巢在银屑病发病机制中的作用[J].中国麻风皮肤病杂志，2006，12（22）：1012-1014.

［5］ 林景荣.银屑病中T细胞活化与端粒酶表达的研究进展[J].中国麻风皮肤病杂志，2006，12（22）：1006-1008.

［7］ Bhushan M,Moore T,Herrick AL,etal.Nailfold video capillaroscopy in psoriasis[J].Br JDermatol,2000,142:1171-1176.

［8］ 王刚，刘玉峰.银屑病患者外周血单个核细胞对自身角质形成细胞的促生长作用 [J].第四军医大学学报，2001，22(24):2297-2299.