丹槐银屑浓缩丸对豚鼠银屑病样模型组织VEGF、VEGFR含量的影响

2011-05-28 11:50王学军胡二为陶以成
关键词:耳部豚鼠银屑病

王学军,胡二为,陶以成

(1.黑龙江省中医研究院,哈尔滨 150006;2.中国中医科学院,北京 100700)

丹槐银屑浓缩丸是多年治疗银屑病的验方,临床效果明显[1]。方药组成:紫草、白鲜皮、大青叶、黄连、槐花、生地、赤芍、丹参、鸡血藤、白茅根、泽泻等共11味中药组成,其中以紫草为君,白鲜皮、大青叶、黄连、生槐花、赤芍、生地为臣,丹参、鸡血藤、白茅根、泽泻为佐。本方诸药相互配伍,既能清解热毒又无苦燥伤阴之弊,凉血分热而无肤络瘀阻之虞,血分热毒得解,肌肤得养,鳞屑自退而痒止。诸药相伍共奏清热解毒、凉血活血、祛屑止痒之功。主治:血热风燥型白疕(进展期银屑病)。银屑病主要病理特征为角质形成细胞增殖加快,角化不全,真皮毛细血管扩张,以及炎症细胞浸润。为此,我们构建了豚鼠耳部的银屑病样病理改变模型,观察丹槐银屑浓缩丸治疗后的病理变化、VEGF及VEGFR水平,以期为丹槐银屑浓缩丸治疗银屑病的临床应用提供可靠的实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要药品及试剂 丹槐银屑浓缩丸:由黑龙江省中医研究院制药厂提供(临床研究批件号:黑L20080011,批号:090501)。复方青黛胶囊:陕西天宁制药有限责任公司(功能主治:清热解毒,化斑消瘀,祛风止痒。用于进行期银屑病。国药准字Z20010157, 批 号 :20090303)。 盐 酸 普 萘 洛 尔(Propranolol hydrochloide):Sigma公司,美国(货号:p0884)。 氨甲喋呤(Methotrexate):Pfizer(Perth)Pty Limited,澳大利亚(进口药品注册号:H20050413,批号:DW47E)。豚鼠VEGF和VEGFR酶联免疫试剂盒:R&D 公司(Minneapolis,MN,USA)。

1.2 主要实验仪器 BIO-RAD680伯乐酶标仪,美国。DV214C奥豪斯精密电子天平,美国。OLYMPUS(XSZ-H型)光学显微镜,日本。IKA匀浆器,德国。

1.3 实验动物 4~5周龄普通健康成年豚鼠,体重300~350g,雌雄不限,由哈尔滨市松北区华宇养殖场提供,动物饲养许可证号:SCXX黑2007003。

1.4 实验步骤

1.4.1 模型制备及实验动物分组 参照文献[2]。新进的豚鼠70只饲养1周,雌雄分开,待其状态良好,适应饲养室环境后,第2周开始实验。把豚鼠双耳剃毛,随机分为7组,即:空白组、模型组、西药对照组(甲氨喋呤组)、成药对照组(复方青黛胶囊组)、以及丹槐银屑浓缩丸低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组10只。除空白组豚鼠外,其余六组都用5%普萘洛尔乳剂(黑龙江省中医研究院制剂室配制)均匀涂于双侧耳背,面积1cm2,厚度1mm。4次/d,共3周。

1.4.2 给药方法 造模成功后,开始分组给药。西药对照组给予甲氨喋呤0.78mg/kg;成药对照组给予复方青黛胶囊0.47g/kg;丹槐银屑浓缩丸低、中(人的等效剂量)、高剂量组分别给1.16g/kg,2.32g/kg,4.64g/kg。各药物均溶于生理盐水,给药体积为2mL/kg。空白组和模型组灌服生理盐水2mL/kg。甲氨喋呤每隔2d一次,其他药1次/d,共2周。每隔2d量体重1次,调整给药量。

1.4.3 取材及材料处理 用药2周后取材,5%乌拉坦麻醉数分钟,颈动脉采血后处死,随即取双侧耳组织。耳组织分三份,其中一份液氮冷冻后-80℃冰箱保存(待组织匀浆用),其余两份分别用10%甲醛溶液固定(组织切片)。

将10%甲醛溶液固定的标本石蜡包埋,切片,常规HE染色,中性树胶封片,光学显微镜观察病理改变。每组豚鼠双侧耳组织各做切片2张,用光镜在10×20视野下观察并摄图(通过血球记数盘校正图片的面积),分别随机选取5个视野,对选中视野进行Baker法[3]评分及炎症细胞计数。Baker法积分评估的标准如下:角质层中见有Munro小脓疡计2.0分;过度角化计0.5分;角化不全计1.0分。表皮层中见有颗粒层变薄或消失计1.0分;棘层肥厚计1.0分;皮突延长、基底层迂曲起伏,根据轻、中、重程度分别计0.5、1.0、1.5分;真皮层见有单一核及多形核细胞浸润,根据轻、中、重程度分别计0.5、1.0、2.0分;乳突突出明显计0.5分;真皮浅层毛细血管扩张计0.5分。

1.5 统计学处理 所有数据均用x±s表示。应用SPSS13.0软件,采用t检验和单因素方差分析进行。设P<0.01,P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 丹槐银屑浓缩丸对模型病理改变光镜观察结果 空白组光镜下可见角质层较薄,颗粒层细胞约为1~3层;棘层细胞约3~5层,为多角形;基底层为单层柱状细胞,表皮突平坦;真皮浅层毛细血管扩张不明显,稀疏散在的淋巴细胞。模型组镜下可见广泛角化过度及灶性角化不全;颗粒层变薄或消失;棘层明显肥厚,表皮突下延;毛细血管扩张、充血,真皮浅层及乳头部可见单一核及多形核细胞浸润。各组豚鼠耳部银屑病样病理改变Baker评分及炎症细胞浸润数评分见表1。

方差分析结果表明:模型组和其余各组相比Baker评分和炎症细胞浸润数具有显著差异(P<0.01),提示造模成功,各用药组用药有效。西药对照组疗效优于成药对照组(P<0.05),中、低剂量组疗效接近西药对照组(P>0.05),而高剂量组疗效接近成药对照组(P>0.05)。高、中、低各个剂量组之间,中剂量疗效较好,低剂量组次之,高剂量组较差。中、低剂量组与西药对照组镜下均可见角化过度及角化不全现象明显减轻,棘层变薄,表皮突明显变平,未见Munro微脓疡。见图1。提示丹槐银屑浓缩丸对豚鼠耳部银屑病样病理改变和炎症现象具有抑制作用。但是,随着剂量的升高,作用却减弱,提示量-效关系不成正比,具体原因有待进一步考察。

表1 各组豚鼠耳部银屑病样病理改变Baker评分及炎症细胞浸润数评分(±s)

表1 各组豚鼠耳部银屑病样病理改变Baker评分及炎症细胞浸润数评分(±s)

注:与模型组比较 *P<0.01;与西药对照组比较▲P<0.01,茛P<0.05;与成药对照组比较#P<0.05。

n 10 10 10 10 10 10 10 Baker评分1.25±0.88*5.80±1.06 2.95±0.90*3.90±0.84*3.95±0.84*▲3.10±0.97*3.20±0.85*组别空白组模型组西药对照组成药对照组高剂量组中剂量组低剂量组炎症细胞浸润数评分4.05±1.43*25.30±6.43 9.80±2.90*14.90±4.18*16.40±5.33*茛▼10.60±5.02*#11.40±3.27*

图1 各组豚鼠耳部皮肤常规病理像(HE染色×100)

2.2 丹槐银屑浓缩丸对模型耳部组织匀浆VEGF、VEGFR含量的影响(双抗体夹心酶联免疫法) 见表2。方差分析结果表明:丹槐银屑浓缩丸各组对模型组织VEGF影响不大,但对VEGFR影响有显著差异(P<0.01)。说明丹槐银屑浓缩丸主要通过调节VEGFR来对模型微血管发生作用的。

表2 各组豚鼠耳部组织匀浆VEGF、VEGFR含量(±s)

表2 各组豚鼠耳部组织匀浆VEGF、VEGFR含量(±s)

注:与模型组比较#P<0.05,*P<0.01;与西药对照组比较茛P<0.05;与成药对照组比较▲P<0.01。

n 10 10 10 10 10 10 10 VEGF(ng/L)459.32±38.99#498.81±54.15 472.57±42.41 465.54±37.89 490.00±31.48 467.41±41.48 486.08±34.77组别空白组模型组西药对照组成药对照组高剂量组中剂量组低剂量组VEGFR(ng/mL)13.75±2.50*31.53±4.34 19.39±3.73*25.06±2.68*茛24.04±2.69*▼19.47±3.62*▲20.49±4.56*▲

3 讨论

目前越来越多的研究表明,银屑病的发生发展与血管内皮生长因子及其受体密切相关。寻常性银屑病患者皮损处的血管内皮生长因子(VEGF)mRNA及其蛋白、受体和微血管密度表达明显强于正常人对照组,患者血清中VEGF水平明显高于正常人对照组,VEGF及其受体在银屑病新生血管形成中起重要作用[4]。VEGFR在银屑病发病过程中协同VEGF造成微循环的病理变化。文中结果显示,模型组组织匀浆VEGF和VEGFR水平与空白组相比,差异较为显著,各用药组组织VEGF水平均有所降低,但差异不明显。但是各用药组VEGFR水平显著降低,尤其是丹槐银屑浓缩丸中剂量组效果较好,疗效和西药对照组相似。本实验的结果表明,丹槐银屑浓缩丸对皮损VEGF和VEGFR水平具有调节作用,可能是通过降低VEGFR水平来发挥作用。

[1] 王学军,贾丽梅.丹槐银屑浓缩丸治疗寻常型银屑病264例临床观察[J].中国中医药科技,2008,15(6):474-475.

[2] 黄畋,张淑芝,孙令.心得安涂药造成豚鼠耳部银屑病样病理变化[J].中华皮肤科杂志,1991,24(2):96-97.

[3] Baker BS,Brent L,Valdimarsson H,etal.Is epidermal cell proliferation in psoriatic skin grafts on nudemice driven by T-cell derived cytokines?[J].Br JDermatol,1992,126:105-110.

[4] 张锡宝,罗权,吴志华,等.血管内皮生长因子及其受体在银屑病发病中的作用及意义[J].中华皮肤科杂志,2005,38(3):140-142.

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