牡荆素对大鼠心肌缺血再灌注损伤诱导细胞凋亡的影响

董六一， 范一菲， 邵 旭， 陈志武

(1.安徽医科大学药理学教研室，安徽合肥 230032;2.合肥七星医药科技有限公司，安徽合肥 230088)

心肌缺血再灌注损伤时心肌细胞死亡有坏死和凋亡两种形式，其中心肌细胞凋亡在I/R后的损伤形成过程中起主导作用［1］。细胞凋亡的发生、发展受多种基因调控，其中Bcl-2基因和Bax基因被认为与细胞凋亡关系密切［2-3］。山楂系蔷薇科植物，是我国传统中药，主要有助消化作用，现代药理学研究发现［4-6］，山楂叶中提取的黄酮类化合物具有降血脂、降血压、增加冠脉流量、保护心肌缺血、抗氧化等作用。牡荆素(vitexin)是从山楂叶中提取的有效成分，我们前期研究发现，牡荆素对缺氧复氧心肌细胞具有明显的保护作用［7］。本实验在大鼠Langendorff离体心脏缺血/再灌注模型上，采用TUNEL技术及电镜细胞超微结构观察相结合，并采用免疫组化方法检测Bcl-2，Bax等相关凋亡基因的表达，研究了牡荆素对大鼠心肌缺血-再灌注损伤诱导细胞凋亡的影响。

1 材料

1.1 实验动物 清洁级SpragueDawleg(SD)大鼠，雄性，体质量250～280 g，由安徽医科大学实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(皖)2005-001，实验室饲养温度:(22±3)℃。

1.2 药品与试剂 牡荆素:合肥七星医药科技有限公司提供，冻干粉针，规格:10mg/瓶，批号:20041101，临用前用生理盐水(NS)配制成所需浓度;水合氯醛:中国上海白鹤化工厂，批号:990510;小鼠单克隆抗体Bcl-2，Bax:美国SantaCruz公司产品，购自北京中山生物科技股份有限公司;TdT介导的原位末端标记法检测细胞凋亡试剂盒:北京中山生物科技股份有限公司产品;液体DAB酶底物显色试剂盒:北京中杉生物科技股份有限公司;其他试剂均为市售分析纯。

1.3 仪器与设备 MDF-192 ULTRA-LOW TEMPETATURE FREEZER(超低温冰箱):SANYO Electric CO.Ltd.Made in Japan;RM2135型石蜡切片机:德国Leica公司产品;数码成像系统:日本NIKON公司产品;BK1000光学显微镜:重庆光学仪器厂;Eclipse80i免疫荧光显微镜:日本Nikon公司产品;JEM-100SX透射电子显微镜:日本电子株式会社产品。

2 方法

2.1 离体大鼠缺血缺氧再灌注损伤模型的制备［8］腹腔注射(ip)10%水合氯醛将大鼠轻度麻醉，开胸后迅速取出心脏置于4℃氧饱和的KH液中，立即经主动脉插管悬挂于Langendorff装置上，灌流液为38℃氧饱和的KH液［灌流液(mmol/L)组成(NaCl:105.7，KCL:5.36，CaCl2:1.28，MgCl2.6H2O:1.084，KH2PO4:1.18，NaHCO3:18，GS:11，pH:7.4 ±0.5)］。在实验过程中，离体心脏被随机分为3组:(1)对照组:仅以KH液持续灌流90 min;(2)I/R组:稳定灌流30 min，停止灌流30 min，然后再灌注30 min;(3)牡荆素组:预平衡灌流10 min，然后再用含100 μmol/L的KH液灌流20 min，其他处理与I/R组相同。再灌注结束后迅速用利刃取心尖部缺血心肌1 mm×1 mm×1 mm的组织块置于2.5%戊二醛溶液(4℃)中前固定，行电镜检查;然后取左心室心尖部组织置于10%甲醛溶液中，常规石蜡包埋，行TUNEL检查及免疫组化检测。

2.1.1 TUNEL法检侧细胞调亡 标本常规10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋、切片。切片常规脱蜡入水。新鲜配制3%H2O2，室温处理10 min，蒸馏水洗涤2 min，洗3次，标本片加入TBS以1:100新鲜稀释的Proteinase K，37℃消化15 min，加标记缓冲液20 μL/片，以保持切片湿润。按每张切片取TdT和DIG-dUTP各1μl，加入18 μL标记缓冲液中，混匀，甩去切片上多余的液体后加标记液20 μL/片，置样品于湿盒中，37℃标记2 h。TBS洗2 min，洗3次，加封闭液50 μL/片，室温30 min，甩掉封闭液，不洗，用封闭液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体，50 μL/片加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃反应30 min。TBS洗2 min，洗3次，用 TBS 1:100 稀释 SABC，取1 mL TBS 加 SABC 10 μL，混匀后加至切片，37℃反应30 min，TBS洗5 min，洗4次，DAB显色，显色30 min左右，水洗，苏木素轻度复染，TBS及蒸馏水冲洗，脱水，透明，封片，显微镜观察。

结果判定:细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。将Tunel切片于光镜下400倍放大，通过图像分析仪每张切片随机选择10个视野，测定阳性染色的平均光密度与阳性细胞百分比(指阳性细胞占视野中所有细胞数的百分比)，计算细胞凋亡指数(apoptosis index，AI):AI(%)=平均光密度×阳性细胞百分比×100%。

2.1.2 Bax，Bcl-2基因蛋白免疫组化检测 标本常规10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片。石蜡切片脱蜡至水，用 PBS(0.01 mol/L pH 7.4)冲洗3 次，每次5 min，每张切片加50 μL 0.3% 的过氧化氢甲醇溶液室温处理30 min，以阻断内源性过氧化酶。PBS冲洗3次，每次5 min，每张切片加50 μL正常非免疫动物血清，室温处理20 min，吸去多余的液体。每张切片加50 μL第一抗体，室温湿盒孵育60 min，PBS冲洗3次，每次5 min，每张切片加50 μL生物素标记的第二抗体，室温湿盒孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，每张切片加50 μL链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，室温湿盒孵育10 min，PBS冲洗3次，每次5 min，每张切片加100 μL新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察10 min，自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。以PBS代替一抗进行反应作阴性对照。

Nikon 80i免疫荧光显微镜下观察，并对每组切片随机取10个不重叠的视野拍照。采用捷达801D形态学图像分析系统(Version 6.0)对所得照片进行计算机图像分析，统一参数设定保持基线一致，其阳性追踪点为表达于胞浆或胞膜的棕黄色定位。计算切片各视野阳性点面积总和及光密度均值，以阳性点面积总和/阳性点光密度均值表示阳性表达强度。

2.1.3 电镜观察凋亡细胞的超微结构 取心尖部缺血心肌1 mm×1 mm×1 mm的组织块置于2.5%戊二醛溶液(4℃)中前固定，PBS液冲洗，1%锇酸后固定(4℃)1 h，PBS液冲洗，梯度脱水，环氧树脂渗透(Epon 812)，平板包埋36h，切片50～70 nm，醋酸双氧铀和柠檬铅双染色，H600透射电镜下观察。

2.2 统计学处理 所有实验数据采用SPSS 11.0进行统计分析。计数资料以均数±标准差(±s)表示，采用随机区组设计的单因素方差分析(ANOVAO)，检验显著性水平定于P＜0.05。

3结果

3.1 牡荆素对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响 模型组细胞凋亡指数显著高于正常对照组(P＜0.01)。牡荆素(100、50、25 μmol/L)组与 I/R 组比较，细胞凋亡指数显著降低(P＜0.01)。提示牡荆素可以通过抑制MI/R大鼠心肌细胞凋亡，从而起到保护缺血/再灌注心肌损伤的作用，见表1。

3.2 牡荆素对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡基因Bax，Bcl-2蛋白表达的影响 Bax，Bcl-2蛋白阳性反应为黄色或棕黄色颗粒，弥漫性分布，定位于胞膜、胞浆。正常对照组有少量Bax或Bcl-2蛋白表达，模型组Bax或Bcl-2蛋白表达较正常对照组显著增加(P＜0.01，P＜0.05)。与模型组比较，牡荆素组Bax蛋白表达显著减少(P＜0.01)。与模型组比较，牡荆素组对上述两种蛋白表达显著增加(P＜0.05)，Bcl-2/Bax的比值明显上升，抑制了细胞凋亡，造成细胞凋亡指数下降。结果见表2。

表1 牡荆素对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡指数的影响(± s，n=8)

表1 牡荆素对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡指数的影响(± s，n=8)

注:与对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组别 剂 量/(μmol/L) Apoptosis Index(%)对照组 —1.23 ±0.17模型组 — 23.56±4.58△△牡荆素 100 12.79 ±3.21＊＊50 14.34 ±2.98＊＊25 17.62 ±3.43*葛根素 120 16.89 ±4.61*

表2 牡荆素对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡基因Bax，Bcl-2蛋白表达的影响(± s，n=8)

表2 牡荆素对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡基因Bax，Bcl-2蛋白表达的影响(± s，n=8)

注:与对照组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax ratio对照组 —组 别 剂 量/(μmol/L)1.08 166.60 ±37.73 154.84 ±66.52 1.08模型组 — 273.08±117.87△ 421.02 ±106.92△△ 0.65牡荆素 100 386.50±87.86* 227.07 ±86.72＊＊ 1.70 50 299.95 ±97.83 269.35 ±73.58＊＊ 1.11 25 275.43 ±127.20 300.49 ±102.09* 0.92葛根素 120 304.77 ±117.80 282.68 ±63.95＊＊

3.3 牡荆素对电镜观察凋亡细胞超微结构的影响 电镜下对照组心肌肌丝走行规整，无明显溶解破坏;I/R组心肌细胞超微结构发生明显改变，细胞核有异染色质边集现象;肌膜破损，肌原纤维溶解断裂、肌丝排列紊乱，结构不清，明暗带和Z线基本消失;线粒体肿胀，大小不等，嵴变平甚至消失，空泡形成，部分线粒体固缩，未见到典型的凋亡小体。牡荆素组(100、50 mol/L)心肌细胞损伤明显减轻，细胞轻度水肿，肌膜完整，肌纤维排列规则，明暗带分明，Z线结构清晰，但Z线明显增宽;线粒体丰富，嵴密集，排列规则，无明显线粒体肿胀与空泡形成。提示牡荆素可减轻缺血再灌注损伤对大鼠心肌细胞超微结构的变化，从而对心肌产生保护作用。见图1。

图1 牡荆素对电镜观察凋亡细胞超微结构的影响(×10 000)

4讨论

心肌细胞凋亡是心肌缺血早期心肌细胞死亡的主要原因，而缺血-再灌注损伤则加速加重其凋亡［9］。抑制细胞凋亡则能显著缩小缺血-再灌注所致心肌梗死的面积［10］。本实验结果证实，牡荆素可显著减少大鼠离体心脏缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡，其抗凋亡作用可能是牡荆素保护心肌的重要机制之一。目前研究发现，许多基因参与介导细胞凋亡信号的调控过程。其中，Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡过程中起到重要的加速和延缓作用［11］。Bcl-2基因是一个重要的凋亡抑制基因，其蛋白通过影响线粒体释放细胞色素C的过程来调节细胞凋亡［12-13］。Bax基因是Bcl-2基因家族中的一个促凋亡基因，是Bcl-2基因的拮抗基因，主要表达于线粒体膜和内质网膜上，它通过和Bcl-2形成异二聚体而抑制Bcl-2的功能，并有研究认为Bcl-2/BAX比值是凋亡调控的指标之一，Bcl-2/BAX比值的高低是决定对细胞凋亡发挥何种作用的关键因素［14］。本研究结果显示，牡荆素各剂量组与模型组相比较，心肌中Bcl-2蛋白表达升高，Bax蛋白表达下降，但其与对照组相比，Bax蛋白表达仍稍高，由此推测牡荆素能通过促使Bcl-2恢复正常，抑制BAX升高，提高Bcl-2/Bax比值，从而抑制心肌缺血再灌注所致的心肌细胞凋亡。心肌细胞超微结构的改变是反映细胞损伤最直观的指标，心肌细胞中线粒体对缺血缺氧十分敏感，是决定细胞由可逆到不可逆改变的关键细胞器，线粒体弥漫性肿胀，膜破裂、嵴溶解消失，空泡形成等均是缺血造成的损伤［15］。在心肌细胞凋亡时，线粒体结构与功能发生明显变化，且与心肌细胞凋亡显著相关［16］。本研究发现，牡荆素给药组心肌损伤程度较模型组(I/R)明显改善，明显减轻心肌细胞超微结构的变化，从而对心肌产生保护作用。以上实验结果证实，牡荆素通过上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，稳定线粒体膜，阻止心肌细胞凋亡的发生，减轻心肌细胞损伤，从而对心肌细胞起保护作用。

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