当归四逆汤有效成分组合对大鼠缺血再灌注模型中iNOS eNOS表达相关性的实验研究

钱国强， 蔡 川， 梁雪冰， 赵国平

(暨南大学医学院，广东广州 510632)

当归四逆汤为《伤寒论》治疗血虚寒厥之方剂，现代药理研究表明该方有抗凝、抗血栓、扩血管、镇痛抗炎的作用［1］，临床运用于冻伤、血栓闭塞性脉管炎、雷诺氏综合征、冠心病、下肢动脉闭塞以及静脉血栓形成［2］，目前在该方中发现了 4 种有效成分［3］，且芍药苷［4－7］、阿魏酸［8］、甘草酸［9］、肉桂酸［10］均对缺血再灌注损伤有干预作用。缺血预处理(ischemic preconditioning，IP)可明显减轻随后的缺血再灌注损伤，但其机制尚有待于研究。以至于缺血与处理有关的物质腺苷、乙酰胆碱、缓激肽等均可促进eNOS诱导的一氧化氮(nitric oxide，NO)合成，提示NO可能参与了缺血预处理。本研究采用当归四逆汤有效成分单体组合进行药物缺血预处理，研究当归四逆汤缺血预处理对大鼠心肌的保护作用及其机制，以期探寻其是否与NO途径有关。

1 材料

1.1 实验动物 雄性SD大鼠32只，体质量250～300 g(购自广东省实验动物中心，许可证号SCXK(粤)2008－0002)。

1.2 试剂及器材 芍药苷、阿魏酸、甘草酸、肉桂酸(购自南京泽朗医药科技有限公司)，L－NAME(sigma公司)，NO ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)、肌酸激酶同工酶(CK－MB)测定试剂盒(北京华宇亿康生物科技有限公司)。全自动生化分析仪(日立7020)，动物呼吸机(ALC－V，

上海奥尔科特生物科技有限公司)，全波长荧光扫描酶标仪(Safire 2，北京东胜创新生物科技有限公司)，心电图机(生物机能实验系统，成都遨升电子公司，型号:ASB240V)，PCR仪(BIO－RAD，CFD－3120)。

2 方法

2.1 模型与分组

2.1.1 心肌缺血再灌注模型建立 SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg体质量)，固定后行气管切开，气管插管，连接呼吸机并给予机械通气，通气量为5 mL/100 g体质量;呼吸频率为60～80次/min，呼吸比为2∶1，予呼气末持续正压呼吸，于胸骨左缘2～4肋间打开胸腔及心包膜，暴露心脏;在肺动脉圆锥右缘、平左心耳下缘1～2 mm处，经左冠状动脉下浅层心肌穿5/0号丝线，结扎，模型复制的可靠性用连续监视ECGⅡ导联的变化来判断，以ST段抬高为心肌缺血存在，以ST段回落1/2为再灌注成功。

2.1.2 实验分组 32只大鼠分为4组(正常组，IR组，IR+药组，IR+药+L－NAME组)，每组8只。正常组未经缺血再灌注处理;IR组SD大鼠心肌缺血30 min再灌注120 min后取材;IR+药组于实验前30 min灌胃，灌胃剂量为甘草酸50 mg/kg，阿魏酸 400 mg/kg，芍药苷 100 mg/kg，肉桂酸 400 mg/kg［3］，再灌注120 min 取材;IR+ 药 +L－NAME 组于实验前30 min灌胃，灌胃剂量为甘草酸50 mg/kg，阿魏酸400 mg/kg，芍药苷100 mg/kg，肉桂酸400 mg/kg，并于再灌注前15 min给予 L－NAME 30 mg/kg，再灌注120 min取材。

2.2 NO检测 取血后静置30 min，4℃离心15 min，取血清按照试剂盒说明检测。

2.3 CK－MB检测 按照(CK－MB)测定试剂盒在全自动生化仪上进行。

2.4 eNOS mRNA和iNOS mRNA的测量 采用实时荧光定量法测定eNOS mRNA和iNOS mRNA的测量，以DAPDH为内参，DAPDH 引物为:5′－ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC－3′和 5′－TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA－3′，eNOS 引物为5′－CGA GAT ATC TTC AGT CCC AAG C－3′和 5′－GTG GAT TTG CTG CTC TCT AGG－3′，iNOS 引物设计为 5′－TCT GTG CCT TTG CTG ATG AC－3′和 5′－CAT GGT GAA CAC GTT CTT GG－3′，RNA抽提按照试剂盒说明进行，测纯度 OD260/290在1.9～2.1之间良好，按照试剂盒说明书将反应设为50 μL体系，95℃变性2 min，40循环扩增(95 ℃10 s，60 ℃ 15 s，68℃ 30 s)，完成实验后数据采用2－ΔΔct分析。

2.5 统计分析方法 所有数据以均数±标准差表述，组间差异比较用单因素方差分析，两两数据比较用SNK检验。

3 结果

3.1 NO、CK－MB 检测结果 见表1。

表1 测得NO、CK-MB质量浓度方差分析结果

3.2 eNOS mRNA、iNOS mRNA的测定结果 见表2。

表 2 eNOS mRNA、iNOS mRNA 测得量(2 －ΔΔct)

4 讨论

1987年Palmer等［11］发现NO就是内皮源性舒张因子(endothelium－derived relaxing factor，EDRF)，目前研究认为在基础状态下血管内皮细胞的NO释放对维持心血管系统处于恒定的舒张活性状态，调节血压，调节冠状动脉基础张力和心肌血流灌注有重要作用。NO使血小板中cGMP水平升高，导致胞浆游离钙进入亚细胞器而使其浓度降低，从而抑制其聚集黏附［12］，在血管内皮细胞、平滑肌细胞及粒细胞中均有NO存在，在炎症时它过量产生可以使血管通透性增加，炎细胞、蛋白渗出加剧。有研究提示心肌缺血再灌注后NO生成受损，应用NO前体L－精氨酸增加NO产生，具有保护作用［11］。有研究证实 NO对缺血再灌注有保护作用［13］，有研究表明一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制剂L－NAME等减少了NO的生成，并未加重损伤［14］，也有研究表明减少NO生成以后，使损伤明显加重［15］。另有报道缺血－再灌注心肌NO产生大量增加，应用NOS抑制剂L－单甲基精氨(L－NMMA)和 L－硝基精氨酸甲酯(L－NAME)抑制NO的产生，能够减低心肌损伤［16］，又有实验证实，缺血再灌注心肌过量NO的产生系心肌iNOS活性升高所致，过量NO参与心肌脂质过氧化，损伤心肌［17］。我们的实验研究表明，缺血再灌注的心肌iNOS表达升高，eNOS表达降低，再灌注期间NO生成减少，CK－MB生成增加。故可以认为，再灌注期间NO的产生，是基于心肌NOS同工酶的变化。本研究认为当归四逆汤有效成分组合对缺血再灌注心肌有保护作用，其保护作用通过调节iNOS mRNA和eNOS mRNA表达，调节NO生成，从而起到保护心脏的作用。

［1］苗明三，王升启.现代方剂学［M］.11版.北京:清华大学出版社，2004:885.

［2］杨进平.近5年来当归四逆汤临床应用进展［J］.中医药临床杂志，2008，20(5):538－540.

［3］赵 欣，谷 艳，宋欣鑫，等.HPLC法同时测定当归四逆汤中4种有效成分的含量［J］.沈阳药科大学学报，2008，25(3):200－203.

［4］Tsai H Y，Lin Y T，Chen C F，et al.Effects of veratrine and paeoniflorin on the isolated rat aorta［J］.J Ethnopharmacol，1999，66:249 –255.

［5］He Xihui，Xing Dongming，Ding Yi，et al.Effects of cerebral ischemia－reperfusion on pharmacokinetic fate of paeoniflorin after intravenous administration of Paeoniae Radix extract in rats［J］.J Ethnopharmacol，2004，94:339 – 344.

［6］Chen Dongmei，Xiao Liang，Cai Xin，et al.Involvement of multitargets in paeoniflorin－induced preconditioning［J］.J Pharmacol Expl Ther，2006，319:165－180.

［7］Kigore K S，Tanhehco E J，Park J L，et al.Reduction of myocardial infract size in vivo by carbohydrate－based glycomimetics［J］.J Pharmacol Exp Ther，1998，284:427－435.

［8］Cheng Chinyi，Su Shanyu，Tang Nouying，et al.Ferulic acid provides neuroprotection against oxidative stress－related apoptosis after cerebral ischemia－reperfusion injury by inhibiting ICAM－1 mRNA expression in rats［J］.Brain Res，2008，1209:136 –150.

［9］Subramanian S，Bowyer M W，Egan J C，et al.Attenuation of Renal Ischemia－Reperfusion Injury with Selectin Inhibition in a rabbit model［J］.A J Surg，1999，6:573－575.

［10］陈 非，傅延龄，邹丽琰，等.肉桂酸对心缺血再灌注损伤的保护作用［J］.中国医药学报，1999，14(1):68－69.

［11］Palmer R M，Ferrige AG，Moncada S ，et al.Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium derived relaxing factor［J］.Nature，1987 ，327:524 －526.

［12］Kayama N，Grisham M B，Kenvil C G，et al.Effect of reactive oxygen metabolites on endothelial permeability:role of Nitric oxide and iron［J］.Microcirculation，1999，6(2):107，116.

［13］Vegh A，Szekeres L，Parrat J.Preconditioning of the ischemic myocardium;involvement of the L－arginine nitric oxide pathway［J］.Br J Pharmacal，1992，107(3):648－652.

［14］Pabla R，Curtis M J.Effect of endogenous nitric oxide on cardiac systolic and diastolic function during ischemia and reperfusion in the rat isolated perfused heart［J］.J Mol Cell Cardial，1996，28(10):2111－2121.

［15］Napoli P D，Taccardi A A，Grilli A，et al.Chronic treatment with rosuvastatin modulates nitric oxide synthase expression and reduces ischemia– reperfusion injury in rat hearts［J］.Cardiovasc Res，2005，66(3):462 –471.

［16］Zhang Y，Bissing J W ，Xu L ，et al.Nitric oxide synthase inhibitors decrease coronary sinus free radical concentration and ameliorate myocardial stunning in an ischemia－reperfusion model［J］.J Am Cell Cardiol，2001，38(2):5462554.

［17］Liu P，Hock C E，Nagele R，et al.Formation of nitric oxide，superoxide，and peroxynitrite in myocardial ischemia－reperfusion injury inrats［J］.AmJPhysiol，1997， 272(41):H232722336.