基于RSM法优化补骨脂中总呋喃香豆素的提取工艺

陈 京， 姜春波， 熊耀康

(浙江中医药大学，浙江杭州 310053)

补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果实，味辛，苦，归肾、脾经，具有补肾壮阳、纳气、温脾止泻之功效。补骨脂的化学成分主要是香豆素类、黄酮类和单萜类化合物，其香豆素类具有抗肿瘤［1］、抗抑郁［2］、平喘［3］、防治骨质疏松［4］等作用，其中呋喃香豆素类为补骨脂的主要活性物质［5］，由于补骨脂中呋喃香豆素类成分无酚羟基，而其他成分有酚羟基，故本实验采用加热回流的方法从补骨脂中提取总呋喃香豆素，聚酰胺柱层析对总呋喃香豆素进行富集，以总呋喃香豆素量为考察指标，利用响应面分析法［6］，运用Design–Excerpt软件对影响补骨脂中总呋喃香豆素量的主要因素进行考察和评价，以确定从补骨脂中提取总呋喃香豆素的最佳工艺。

1 仪器与材料

TU-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。补骨脂购自本校中药饮片厂，经本校药学院熊耀康教授鉴定为Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果实。补骨脂素(批号:110739-200613购自中国药品生物制品检定所)。聚酰胺(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)。所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 聚酰胺的预处理 取聚酰胺以95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入柱中。用3～4倍体积的95%乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣(或极少残渣)。用2～2.5倍体积5%NaOH溶液洗涤，再用蒸馏水洗至pH值为中性，然后用2～2.5倍体积的10%盐酸溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至pH中性，烘干备用。

2.2 样品溶液的制备 精密称取补骨脂药材10 g，加甲醇适量，加热回流提取1.5 h，提取2次，合并滤液，加一定量聚酰胺粉末搅匀后静置，挥干甲醇，装柱，30%乙醇洗脱，洗脱液经干燥后加甲醇溶解，定容后得供试品溶液，备用。

2.3 总香豆素的测定［7］

2.3.1 对照品溶液的制备 取补骨脂素对照品4.0 mg，精密称定，加甲醇溶解后定容至10 mL，再精密吸取1 mL，加甲醇定容至25 mL，摇匀，即得对照品溶液(每1 mL中含有补骨脂素 16 μg)。

2.3.2 标准曲线的绘制 精密吸取上述对照品溶液1、3、5、7、10 mL，加甲醇定容至10 mL，于245 nm处测定吸光度，并以吸光度为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。得标准曲线方程y=123.05x+0.008 2(r=0.999 7)。结果表明补骨脂素在1.6～16 μg/mL质量浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.4 RSM法优化总呋喃香豆素提取工艺

2.4.1 实验设计与结果 Box-Benhnken试验是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法［8］。本实验采用软件Design–Excerpt 7.0.0中的 Box-Benhnken试验设计原理，选取液料比(A)、提取温度(B)和聚酰胺用量(C)为实验的三因素，每个自变量的低、中、高水平分别以－1、0、1进行编码(见表1)，以总呋喃香豆素质量分数(%)为响应值(Y)，响应面分析方案及结果见表2。

表1 实验因素及水平

2.4.2 模型的建立及方差分析结果 利用 Design-Expert 7.0.0软件对表2数据进行多元回归拟合，得到补骨脂总呋喃香豆素提取率(Y)对液料比(A)、提取温度(B)和聚酰胺用量(C)的二次多项回归模型:Y=1.02+0.068A+0.408 7B+0.031C+0.042AB－ 0.023AC+0.014BC－ 0.031A2－0.057B2－0.167C2

表2 响应面分析方案及结果

该方程的相关系数R2=0.984 5，表明响应值Y(总呋喃香豆素提取率)实际值与预测值之间具有较好的拟合度，因此，该模型可以用于预测总呋喃香豆素提取率的实际情况。从方差分析结果(表3)可知，整体模型达极显著水平(P＜0.01)，表明该二次方程模型比较显著，该方程对试验拟合较好，可以对不同条件下的补骨脂中总呋喃香豆素提取率进行预测。由表3可知，A、B、C2达到极显著水平(P＜0.01)。C、AB、B2达到显著水平(P＜ 0.05)。因此各具体实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。另外，该模型的变异系数(C.V)为3.00%，在可接受范围内。

表3 响应面二次回归方程方差分析

2.4.3 提取工艺的响应面分析与优化 根据回归方程，应用Design-Expert 7.0.0软件，选液料比、提取温度和聚酰胺用量这3个因素，在保持1个因素编码值为0时，其它2个因素与响应值关系的三维响应面图和等高线图，通过图可以直观的描述各因素对响应值(总呋喃香豆素得率)的影响和各个因素的交互作用。由图可知，响应曲面均是卷曲向下的凸面，等高线近似为圆形，中心位于所考察区域内，说明在考察的区域范围内存在响应值的极大值，且简单的一次线性方程难以解析。对拟合方程求偏导，可以得到模型的最大值，即补骨脂总香豆素的理论最佳提取工艺条件为:加药材18倍量的甲醇，80℃水浴提取两次(1.5 h/次)，滤液加2.1倍量的聚酰胺粉末搅拌均匀，待甲醇挥干后上柱用30%的乙醇洗脱，其理论值质量分数为1.13%。实测值与预测值的对照图见图1。

图1 实测值与预测值的对照图

2.4.4 验证性试验 为检验模型预测的准确性，在最佳提取条件提取下，进行3次平行验证试验，总呋喃香豆素平均质量分数为1.16%，与理论值间的相对误差为2.59%，说明响应面法优化提取补骨脂中总呋喃香豆素可行。

表4 验证试验结果

3 讨论

响应面分析法是一种集统计学、数学建模和计算机科学为一身，用于优化工艺条件的有效方法［6］。常见的正交设计法和均匀设计法虽可同时考虑几种因素，寻求最佳因素水平组合，但不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。而响应面分析方法是通过中心组合实验研究几种实验因素间交互作用的一种回归分析方法，具有实验次数少、周期短，求得的回归方程精度高等优点，并从图形方面分析寻求最优实验考察因素值，在实验设计中更具优势［9-10］。

本实验通过响应面分析法，利用Design-Expert软件对补骨脂中总呋喃香豆素的提取工艺进行优化，并得到回归方程。回归分析结果表明，液料比项、提取温度项、聚酰胺用量的平方项对总呋喃香豆素含量影响极显著，聚酰胺用量项、液料比和提取温度项、提取温度的平方项对总呋喃香豆素得率影响显著，说明简单的一次线性方程难以解析。通过拟合方程得到补骨脂总呋喃香豆素的提取最佳条件为:加药材18倍量的甲醇，80℃水浴提取两次(1.5 h/次)，滤液加2.1倍量的聚酰胺粉末搅拌均匀，挥干甲醇，装柱，30%乙醇洗脱。模型对总呋喃香豆素含量预测最大值为1.13%，验证值为1.16%，与预测值的相对误差为2.59%，在误差允许范围内(20%)验证值和预测值相吻合较好，说明回归方程能较真实地反映各筛选因素对总香豆素提取率的影响，证明应用响应面法在提高补骨脂总香豆素提取率回归模型较可靠。

［1］Latha P G，Evans D A，Panikkar K R，et al.Immunomodulatory and antitumour properties of Psoralea corylifolia seeds［J］.Fitoterapia，2000，71(3):223-231.

［2］Kong L D，Tan R X，Woo A Y，et al.Inhibition of rat brain monoamine oxidas activities by psoralen and isopsoralen:Implications for the treatment of affective disorders［J］.Pharma Toxicol，2001，88(2):75-80.

［3］杨荣平，寿清耀，涂永勤，等.补骨脂提取物对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞的影响［J］.中药新药与临床药理，2007，18(1):32-34.

［4］余文新，李伟英，李鸿燕，等.补骨脂总香豆素对哮喘大鼠血清cGMP/cGMP的影响［J］.现代中药研究与实践，2006，20(5):27-29.

［5］Chen Y，Wang HD，Xia X.et al.Behavioral and biochemical studies of total furocoumarins from seeds of Psoralea corylifolia in the chronic mild stress model of depression in mice［J］.Phytomedicine，2007，(14):523-529.

［6］吴 伟，崔光华.星点设计-效应面优化法及其在药学中的应用［J］.国外医学:药学分册，2000，27(5):292-298.

［7］寿清耀，王宾豪.紫外分光光度法测定补骨脂药材中总呋喃香豆素含量［J］.时珍国医国药，2006，17(8):1401-1402.

［8］沈 霞，张艳红，袁慧慧，等.响应面分析法优化艾叶粗多糖提取工艺的研究［J］.中成药，2010，32(1):48-51.

［9］房海灵，郭巧生，申海进.响应面法优化野菊花多糖含量测定的前处理条件［J］.中国中药杂志，2009，34(13):1665-1667.

［10］余 杰，崔鹏举，卓健勇，等.响应面分析方法在鸡腿菇多糖提取中的应用［J］.食品科学，2009，30(8):93-96.