一大分子量香菇多糖的提取分离纯化

李石军， 张 玉， 王凯平， 郭 丹， 辜 明

(1.华中科技大学 同济医学院 药学院，湖北 武汉 430030;2.华中科技大学 同济医学院 协和医院 药剂科，湖北武汉 430030)

香菇Lentinus edodes为担子菌纲伞形科真菌，是世界上第二大食用菌。香菇多糖是香菇中最重要的一种生物活性物质，作为一种免疫促进剂，在20世纪60年代已引起人们广泛的兴趣。现代研究表明:香菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤，调节免疫力、降血糖、抗氧化等功能。与传统中草药相比，香菇多糖通过增强机体免疫力间接杀死肿瘤细胞，因而毒副作用极小。在临床上香菇多糖主要用于抑制和防止胃癌、鼻咽癌、直肠癌、乳腺癌和慢性粒细胞病的术后微转移［1-4］。

目前，香菇多糖的提取大多采用水提-醇沉法［5］，得到的粗多糖杂质较多，后期纯化较麻烦，且分子量较小，抗肿瘤活性较差。有文献报道［6］，分子量在 4.0 ×105Da到 8.0 ×105Da的香菇多糖抗肿瘤活性较高。而碱提-醇沉法能得到分子量较大的香菇多糖，本实验以香菇子实体为原料，碱提-醇沉法提取粗多糖，正交试验［7-8］对香菇多糖的碱提工艺进行优化，粗多糖经脱色，去蛋白，超滤后得到分子量在4.0×105Da以上的均一香菇多糖组分，为以后的结构研究及药理药效研究打下了基础。

1 实验原料、试剂和仪器

香菇子实体(产自湖北房县)，医用酒精，实验用水为蒸馏水，其它试剂均为分析纯，电磁炉，Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，722s型可见光分光光度计(上海精密仪器有限公司)，Fluka Dextran Standard系列葡聚糖标准品(瑞士Fluka公司)。

2 实验方法与结果

2.1 香菇粗多糖的提取 经水提过的香菇子实体再用氢氧化钠提取，碱提后用5 mol/L的醋酸调pH到7，离心弃去沉淀，上清液浓缩后醇沉得到粗多糖。

2.2 正交试验优化香菇多糖碱提工艺 选取提取温度、碱的浓度、提取时间3个因素，以多糖提取率(提取率/%=100×香菇粗多糖的质量/香菇子实体的质量)为考察指标进行3因素4水平的正交试验，对香菇粗多糖的碱提工艺进行优化。见表1。

表1 因素与水平

根据表1所列试验因素和水平，选用L16(45)正交试验表设计试验，确定碱提香菇粗多糖的最优工艺，采用苯酚-硫酸法测定糖量。实验结果见表2。

根据正交试验结果进行方差分析，见表3。

从极差R的结果来看，初步得出影响多糖提取率的主次顺序为B＞C＞A，因素B有显著性影响，因素A和C没有显著性影响。根据正交试验各因素的影响顺序如下:A1＞A4＞A3＞A2，B1＞B2＞B3＞B4，C4＞C3＞C2＞C1。因此可初步确定香菇多糖碱提工艺的最佳条件为A1B1C4，即提取温度为35℃，碱的质量分数为5%，提取时间为24 h。

考虑到空白项的偏差平方和较大，为了提高检验的灵敏度和精确度，将检验水平取为a=0.1，对所得结果进行方差分析。从方差分析结果可知，碱的浓度是影响结果的主要因素，对多糖提取率有显著性影响;提取温度和提取时间对结果没有显著性影响。

表2 碱提香菇多糖L16(45)正交试验及结果

表3 方差分析结果

考虑到温度对多糖得率影响不大，因此本实验选取在室温条件下提取粗多糖，因此确定香菇粗多糖的碱提条件为:提取温度为25℃，碱的质量分数为5%，提取时间为24 h。

2.3 香菇粗多糖的纯化 采用脱色和超滤的方法对粗多糖进行纯化，见表4。

表4 H2O2脱色实验结果

结果显示0.5%H2O2不能达到脱色和除蛋白效果，而1.8%和2.8%的H2O2能较好达到脱色和除蛋白的效果。考虑到较高浓度的H2O2会对多糖大分子产生破坏作用，因而本实验采用1.8%H2O2对粗多糖进行脱色。

超滤对脱色后粗多糖进一步纯化，超滤收集的样品经冻干后得到白色絮状精制香菇多糖。

2.4 糖的测定

2.4.1 标准曲线的绘制 采用苯酚-硫酸法［9］测定糖质量分数，以葡萄糖为对照品制备糖定量测定的标准曲线，得线性方程:A=12.542 9C－0.015 0，R2=0.999 0，C:mg/mL。

2.4.2 精制香菇多糖糖量的测定 采用苯酚-硫酸法测定超滤后样品的糖质量分数，实验数据及结果见表5。

表5 精制多糖质量分数测定实验数据

由表5可得超滤后所得产品的平均糖质量分数为95.00%，RSD 为 0.58%。

2.5 分子量测定(高效凝胶色谱法)

2.5.1 色谱条件 色谱柱:PL aquagel-OH MIXED(300 mm×7.5 mm，8 μm)。流动相:0.05 mol/LNa2SO4;体积流量:1 mL/min;标准品:葡聚糖-T系列;进样体积:30 μL;检测器:示差折光检测器;柱温:35℃。

2.5.2 分子量测定的标准曲线 以葡聚糖为标准品，0.05 mol/L Na2SO4为流动相，通过GPC软件，保留时间(min)为横坐标，分子量(Da)为纵坐标得出标准曲线，得线性方程:x为保留时间，单位min;y为分子量，单位Da。

2.5.3 精制香菇多糖的分子量色谱图 采用GPC专用软件绘制各样品的示差色谱图，见图1。其中纵坐标表示信号强度(nR2u)，横坐标表示保留时间(min)。根据保留时间和标准曲线，通过GPC软件即可计算出各洗脱峰对应的分子量。

图1 超滤法所得产品色谱图

图1所示的保留时间为7.356 min，样品的重均分子量Mw:6.054×105Da。由上图可看出样品的分离纯化效果好，干扰组分少，纯度高，可认为是均一分子量的香菇多糖。

2.6 紫外扫描 以0.1 mol/L的氢氧化钠为溶剂，将多糖样品配制成1 mg/mL的溶液。将上述样品溶液在200～400 nm波长处进行紫外扫描。见图2。

图2 香菇多糖紫外扫描图

从紫外扫描图可以看出，210 nm波长处的吸收峰为多糖类物质的特征吸收峰;此外，在280 nm以及260 nm处没有吸收峰，表明样品中不含蛋白质和核酸［10］。

3 讨论

本实验采用碱提-醇沉法从小冬菇中提取香菇粗多糖，香菇子实体先经水提处理，弃去水提液，然后再用碱提，得到的粗多糖颜色较浅，色素等杂质较少，为后续的纯化工作减轻了负担。由于分子量大的香菇多糖水溶性差，不易由水提-醇沉法得到，因此采用碱提-醇沉法。并为得到抗肿瘤活性较好的香菇多糖提供了保证。

通过正交试验对碱提工艺进行优化，最佳提取条件为:提取温度为25℃，碱的质量分数为5%，提取时间为24 h。

香菇粗多糖的纯化采用H2O2脱色和超滤法分离，得到的香菇多糖经糖定量测定、分子量色谱图和紫外扫描分析，纯化后的香菇多糖为均一组分多糖，不含蛋白质和核酸。

因此本实验采用碱提-醇沉法提取分子量在4.0×105Da以上香菇多糖的工艺是可行的，且纯化工艺简单、有效，为以后对香菇多糖的结构分析和药理药效研究奠定了基础。

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