水飞蓟宾乳脂体注射剂在大鼠体内的药代动力学

陈洪轩， 周晓丹， 陈志鹏

(1.黄河科技学院，河南郑州 450000;2.河南大学药物研究所，河南开封 475004;3.甘肃省人民医院，甘肃兰州 730000;4.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210046)

水飞蓟宾(silibinin or silybin，SIL)是菊科植物水飞蓟Silybam marianum(L.)Gaertn果实中提取的黄酮木脂类化合物的最主要成分［1］，水飞蓟宾能够稳定肝细胞膜，保护肝细胞的酶系统，清除肝细胞内的活性氧自由基，从而提高肝脏的解毒能力，避免肝细胞在长期接触毒物、服用肝毒性药物、吸烟、饮酒等情况下受到的损伤，是疗效确切的肝损伤修复药。研究表明，水飞蓟宾还具有良好的治疗高脂血症、消除自由基、抗肝脂质过氧化、抗缺血再灌注损伤作用。临床上用于治疗急慢性肝炎、肝硬化及中毒性肝损伤［2-4］。由于水飞蓟宾难溶于水，口服吸收差，严重削弱了水飞蓟口服制剂的药效。将其制成水溶性的葡甲胺盐［5］、磷脂复合物［6］、固体分散体［7］，可以提高生物利用度。也有科研工作者将其制成水飞蓟宾葡甲氨盐注射剂，但其水溶液不稳定，极易发生降解，制备成冻干粉针虽然可以解决其放置稳定性问题，但是水飞蓟宾葡甲氨盐水溶液的pH值在11左右，注射时局部刺激性较大［8］。乳脂体(emulsome)是1994年Pharmos公司发明的新技术，是新一代的载体系统，中心由甘油三酯组成脂肪核，外周具有一层或多层磷脂层。由于具有脂肪核，类似普通的o/w乳剂，外周又被磷脂层稳定，类似脂质体。它兼具有脂质体和乳剂的特点，可作为亲脂性药物和亲水性药物的载体。研究表明，乳脂体作为药物载体，具有提高生物利用度、缓控释作用［9］、靶向和降低毒性［10-11］、稳定性高、促进药物溶出等作用。本研究将水飞蓟宾制成乳脂体注射剂，以提高水飞蓟宾的生物利用度，并使水飞蓟宾具有一定的缓释作用。本实验考察了水飞蓟宾乳脂体注射剂在大鼠体内的药代动力学特征。

1 仪器与材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪(SPD-6A紫外检测器、LC-5A型高压泵、7125进样阀20 μL样品管，Japan);RE-52AA型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);SHB-III型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);JY92-IIN型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);Zetasizer 3000HS激光粒度分析仪(Malvern公司);LG16-W高速离心机(北京医用离心机厂)。

1.2 药品及试剂 SIL原料药(盘锦格林恩生物资源开发有限公司，含量98%);SIL对照品(中国药品生物制品检定所);Sephadex G-50(台州市路桥四甲生化塑料厂);注射用大豆磷脂(上海太伟药业有限公司，纯度＞92%);三月桂酸甘油酯(东京化成工业株式会社);胆固醇(中国医药集团);甲醇(山东禹王实业有限公司化工分公司，色谱纯);乙腈(上海陆都化学试剂厂，色谱纯);肝素钠(天津市生物化学制药厂)。

1.3 动物 Wistar大鼠，雄性，体质量280～300 g，由河南省动物实验中心提供，为清洁级。

2 实验方法

2.1 水飞蓟宾乳脂体注射剂的制备［12］定量称取大豆磷脂、三月桂酸甘油酯、胆固醇和SIL溶于适量三氯甲烷中，旋转蒸发除去有机溶剂至形成干膜。加入适量PBS振摇水合至形成均一的分散液。超声使粒径达到要求。

2.2 水飞蓟宾乳脂体粒径和Zeta电位的测定 取水飞蓟宾乳脂体混悬液适量，用激光粒度分析仪测量样品的平均粒径和Zeta电位。

2.3 水飞蓟宾乳脂体包封率的测定 采用葡聚糖凝胶(Sephadex G-50)柱层析法分离未包封药物。精密吸取水飞蓟宾乳脂体混悬液0.5 mL上柱分离，

Memu为乳脂体中所包封水飞蓟宾的量，Mtol为乳脂体混悬液中所含的水飞蓟宾的量。

2.4 药动学研究

法治是人类治国理政智慧的结晶，也是我国历史经验教训的科学总结。“枫桥经验”发展，从社会改造和帮教到社会治安综合治理，再到社会管理创新，走上法治化征途，既是必然的选择，也是实践的努力。法院作为“枫桥经验”的践行者和法治建设的生力军，在其中发挥了应有作用。

2.4.1 色谱条件［13］色谱柱:Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm，大连依利特);预柱:C18(20 mm×4.6 mm，5 μm)(天津特纳科学仪器公司);流动相:甲醇-水-冰醋酸溶液(50∶50∶1)，用前分别经0.2 μm 滤膜过滤，超声混匀备用;体积流量:1.0 mL/min;检测波长:288 nm;进样量:20 μL。

2.4.2 血浆样品的处理 精密移取血浆样品100 μL，置于1.5 mL的塑料离心管中，加入乙腈100 μL，涡旋30 s，15 000 r/min 离心5 min，取上清液进样20 μL，记录色谱峰面积。

2.4.3 标准曲线的制备 精密称取6.25 mg的SIL，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为250 μg/mL的贮备液，分别移取此溶液适量置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成水飞蓟宾质量浓度分别为 2、5、10、20、50、125、250 μg/mL的标准品溶液。分别精密移取以上各标准品溶液2 μL至98 μL的空白血浆中，再加入乙腈100 μL，按血浆样品的处理方法操作，得到质量浓度分别为 0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.25、2.5 μg/mL 的标准品溶液，按血浆样品的处理方法操作，以峰面积(A)对质量浓度(C)作图，得到线性回归方程。

2.4.4 回收率和精密度实验 在空白大鼠血浆中加入SIL标准品溶液，使其质量浓度分别为0.05、0.20、1.25 μg/mL，按“血浆样品的处理”操作，计算测得量，与实际加入量比较，计算回收率。分别在日内进样5次;同时连续5日，计算日内和日间精密度。

2.4.5 SIL乳脂体大鼠药动学研究 12只大鼠随机分成两组，每组6只，均按照3.8 mg/kg的剂量给药，第1组尾静脉注射SIL乳脂体，第2组尾静脉注射SIL自配的溶液剂(精密称取水飞蓟宾标准品5 mg，置10 mL量瓶中，再加入4 mL PEG400，水补至10 mL，0.22 μm 滤膜过滤即得制备成 0.5 mg/mL以PBS为洗脱液洗脱，分管接收洗脱液，含乳脂体的接收液合并后以甲醇破乳，稀释至一定浓度后，测得乳脂体中所包封的水飞蓟宾的量Memu，另吸取水飞蓟宾乳脂体混悬液，测得水飞蓟宾乳脂体混悬液中所含的水飞蓟宾的量Mtol，按以下公式计算包封率:水飞蓟宾溶液剂)，给药后分别于 2、5、10、15、30、45、60、90、120、240 min 时间取点，按“血浆样品处理”操作后进样测定，代入标准曲线计算SIL的血药浓度，血药浓度－时间数据经3p97药动学计算程序处理。

3 结果

3.1 水飞蓟宾乳脂体粒径、Zeta电位和包封率

测得水飞蓟宾乳脂体平均粒径为364.1 nm，且粒径分布均匀。Zeta电位为－34.1 mV。测得水飞蓟宾乳脂体的包封率为82.5%。

3.2 体内方法学验证

3.2.1 方法专属性考察 由图1可见，在此液相条件下，水飞蓟宾分离得到水飞蓟宾A(1)和水飞蓟宾B(2)两个峰。水飞蓟宾两个峰均能达到基线分离且峰形稳定，保留时间约为 15.2 min、17.5 min。血浆中杂质不干扰样品的测定。

图1 大鼠血浆HPLC图

3.2.3 回收率和精密度实验 由表1可知，大鼠血浆3种质量浓度各质量浓度点测得的平均值偏离实际加入量均小于15%，定量限附近 RSD%小于20%，可满足生物样品测定要求。

表1 水飞蓟宾在大鼠血浆中的回收率 (n=3)

由表2可知，大鼠血浆3种质量浓度日内、日间精密度RSD%均小于15%，定量限附近RSD%小于20%，满足生物样品分析方法要求。

表2 精密度实验 (n=5)

3.3 药动学结果分析

3.3.1 血药浓度-时间曲线 大鼠分别尾静脉注射SIL溶液剂和SIL乳脂体后的血药浓度-时间曲线见图2。

图2 SIL溶液和乳脂体大鼠静脉给药后的血药浓度-时间曲线图 (n=6)

3.3.2 药代动力学研究 分别将水飞蓟宾乳脂体和水飞蓟宾溶液剂的血浆药物浓度-时间数据代入中国药理学会推荐的3p97程序，以AIC和拟合优度(r2)为判别指标，确定血药浓度隔室模型。以1为权重对数据进行模型嵌合，结果，二种制剂均符合二室模型，其相关药代动力学参数见表3。

表3 SIL溶液剂和乳脂体大鼠体内的药动学参数 (n=6)

从二者的药代动力学参数可知，将SIL包封于乳脂体中能明显改善其体内药动学，与自制的SIL溶液剂相比，t1/2β、CL、AUC、和 MRT 均有显著性差异。

4 讨论

4.1 本实验成功地采用薄膜分散法制备了SIL乳脂体，结果表明，采用薄膜分散法制得的乳脂体为淡蓝色略透明的混悬液。平均粒径为364.1 nm，且粒径分布均匀。Zeta电位为－34.1 mV。包封率为82.5%。

4.2 天然或合成的水飞蓟宾并非单一化合物，而是一对非对映异构体(水飞蓟宾A和水飞蓟宾B)的混合物，且它们都具有药理活性，为了便于计算，将水飞蓟宾A和水飞蓟宾B两个峰的峰面积之和作为定量用。

4.3 本研究制备了注射用水飞蓟宾乳脂体，大大提高了水飞蓟宾的生物利用度。

4.4 本研究建立了HPLC测定大鼠血浆中SIL的含量，应用本方法，研究了大鼠尾静脉分别注射SIL乳脂体和SIL溶液剂后，其血浆中的药物浓度，由大鼠体内药代动力学测定结果表明，二种制剂均符合二室模型。以乳脂体作为SIL的载体制备静脉注射制剂，与自制的 SIL溶液剂相比，t1/2β、CL、AUC 和MRT均有显著性差异。t1/2β由16.06 min延长到35.98 min，CL 由 0.29 mL/min 减小到 0.16 mL/min、AUC 增大2.22 倍，MRT 增大 2.51 倍，提示水飞蓟宾乳脂体改变了水飞蓟宾的体内消除，显著延长水飞蓟宾的体内循环时间。是因为本实验制得的乳脂体，中心具有固体或者半固体的疏水核，外周又被磷脂层稳定，水飞蓟宾等亲脂性药物能被高浓度地包裹入疏水核中，使药物的释放需克服疏水核和磷脂层的双重屏障，具有缓控释作用。

4.5 试验分别采用甲醇沉淀法和乙腈沉淀法，结果表明，乙腈对蛋白的沉淀作用优于甲醇，药物回收率高。

4.6 本研究用一种简单的方法制备了具有多重优点的SIL乳脂体注射剂，为SIL临床用药提供一种高疗效的制剂品种。

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