灵仙新苷微乳的制备及其初步药效学研究

董彩霞， 李默影， 姚 岚， 李丰文， 李运曼， 刘丽芳*

（1.中国药科大学中药分析教研室，江苏南京211198；2.中国药科大学药理学教研室，江苏南京 210009）

灵仙新苷微乳的制备及其初步药效学研究

董彩霞1， 李默影1， 姚 岚1， 李丰文1， 李运曼2， 刘丽芳1*

（1.中国药科大学中药分析教研室，江苏南京211198；2.中国药科大学药理学教研室，江苏南京 210009）

目的 制备均一稳定的灵仙新苷（clematichinenoside，AR）油包水微乳，并初步考察其对佐剂性关节炎原发病变小鼠的治疗作用，为威灵仙中药单体药物制剂的开发提供药效学基础。方法 选用卵磷脂和乙醇分别作为表面活性剂和助表面活性剂，油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M 1944Cs）作为油相，AR水溶液为水相，绘制伪三元相图以确定各成分质量比。通过在小鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂（CFA）制备佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）模型。以体质量、肿胀率、胸腺与脾脏指数为主要检测指标，并观察小鼠病变部位的组织形态来比较AR微乳与AR溶液及阳性对照药白芍总苷的差异。结果 确定Km=1∶1，处方组成为油相50%，混合表面活性剂35%，水相15%，得到AR微乳为澄清的淡黄色溶液，平均粒径为10.7 nm。AR微乳对佐剂性关节炎原发病变小鼠疗效略好于AR溶液，且AR微乳能更好地改善佐剂性关节炎原发病变小鼠的病理形态及病变部位的组织形态。结论 AR皂苷微乳粒径较小，脂溶性强，能够增加药物在体内的生物利用度。这表明微乳作为新的药物剂型具有广泛的应用前景。另一方面由于制剂促进药物吸收的机制并不是单一的，仍需进一步研究。

灵仙新苷；油包水微乳；药效学

中药威灵仙来源于毛茛科植物威灵仙Clematis chinensisOsbeck、棉团铁线莲Clematis hexapetalaPall.或东北铁线莲Clematis manshuricaRupr.的干燥根及根茎。具祛风湿、通经络、止痛等功效［1］。灵仙新苷（clematichinenoside，AR）是威灵仙的皂苷提取物，具有较强的抗炎镇痛作用［2］。但因其相对分子质量较大［3］，水溶性较好，不易通过细胞膜，从而影响其在生物体内的吸收利用。

微乳（microemulsion，ME）是由油相、水相、表面活性剂及助表面活性剂四元体系自发形成的系统，具有外观透明、各向同性、黏度低及热力学性质稳定等特点。油包水型（W/O）微乳作为口服药物载体具有以下优点：可延长水溶性药物的释放时间而起到缓释作用；促进药物的吸收，避免首关效应，可提高药物的生物利用度［4］。

本研究采用伪三元相图法将AR制成油包水（W/O）微乳，并初步考察了AR微乳对佐剂性关节炎原发病变小鼠的治疗作用，为AR乳剂的开发提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 仪器

AUY120型电子分析天平（日本shimadzu公司），微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器公司），WZS-1型阿贝折光仪（上海仪器厂），DV-II+Pro Brookfield粘度计（美国博力飞），粒径分析仪（美国Beckman Coulter N4 plus），Agilent1200液相色谱仪，Diamonsil C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm，美国迪马公司），足跖容积测量器皿（中国药科大学自制）。

1.2 药物与试剂

灵仙新苷（AR），由本实验室提取纯化，纯度大于90%；卵磷脂（国药集团化学试剂有限公司）；油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M 1944Cs，法国佳法赛公司）白芍总苷胶囊（TGP，宁波立华制药有限公司产品，批号：061201），规格：0.3 g/粒（含芍药总苷不少于104 mg）；弗氏完全佐剂（Freund＇s complete adjuvant，sigma公司，批号：058K8702），乙醇为分析纯。

1.3 动物

清洁级小鼠，体质量18～22 g，雄性，共48只，由扬州大学医学中心提供，许可证号：SCXK（苏）2007-0001。

2 方法

2.1 微乳伪三元相图的绘制

精密称取卵磷脂和乙醇按一定比例混合均匀（表面活性剂/助表面活性剂=Km），即为混合表面活性剂，再与油相（油酸聚乙二醇甘油酯，Labrafil M 1944Cs）按不同比例（1 ∶9，2 ∶8，3 ∶7，4 ∶6，5 ∶5，6∶4，7∶3，8 ∶2，9 ∶1）涡旋混合均匀，向混合液中缓慢滴加蒸馏水并不断振摇使体系充分混匀，当体系由澄清透明变浑浊时为临界点，记录临界点时加入的水量，按油，水，混合表面活性剂在临界点的各自质量百分数（w/w）绘制伪三元相图，确定微乳区。

考察不同的Km值对微乳形成区域的影响，在此基础上固定Km值，考察不同的AR水溶液对微乳形成难易的影响。

2.2 AR微乳的制备

取Labrafil M 1944Cs与AR水溶液充分混合，再滴加处方量的混合表面活性剂，涡旋混合均匀，即得到灵仙新苷（AR）油包水微乳。

2.3 微乳测定

定量吸取所制AR微乳，加入甲醇摇匀破乳后定容，参照文献［3］，按外标两点法定量分析单位体积微乳中AR的量。

2.4 微乳理化性质测定

黏度测定：取8～10 mL，加入黏度计圆筒中，连接转子开始测定。

折光率测定：按中国药典2010版规定方法，恒温20℃测定微乳的折光率。

粒径测定：W/O微乳外相为非水介质，因此将黏度和折光率作为粒度分析仪的设定参数后测定。

稳定性：取微乳5 000 r/min离心30 min。

类型鉴别：用染色法［5］来鉴定，即根据红色的油溶性染料苏丹红和蓝色的水溶性染料亚甲基兰在微乳中的扩散快慢来进行判定微乳类型。

2.5 AR微乳初步药效学研究

取清洁级小鼠48只，按体质量随机分为6组，每组8只，分别为：模型组，AR微乳高剂量组（32 mg/kg），AR微乳中剂量组（16 mg/kg），AR微乳低剂量组（8 mg/kg），白芍总苷组（360 mg/kg），AR水溶液组（32 mg/kg）。于致炎前分别测量每只小鼠体质量与足爪容积。测小鼠的足爪容积时用足跖容积测量器皿。右后足跖底部皮内注射0.1 mL完全弗氏佐剂致炎［6］。致炎18 h后，各组采用灌胃的方法给予相应剂量的药物7 d，给药体积为0.2 mL/10 g，每天一次。

给药前，给药第1天，第4天和第7天分别测量各组小鼠的体质量，每天用玻璃容积法测小鼠致炎的右后足足跖容积，计算其肿胀率（%）。最后一次给药24 h后将小鼠处死，切下右足做病理切片，剥离胸腺与脾脏，电子天平称定质量，以平均每100 g体质量的脏器质量作为指标表示脏器指数［7］。

肿胀率=（致炎后足跖容积—致炎前足跖容积）/致炎前足跖容积×100%

3 结果

3.1 Km值及AR水溶液浓度对微乳形成的影响

选用Km 分别为1 ∶3、1 ∶2、1 ∶1、1.5 ∶1、2 ∶1，AR水溶液质量浓度为150 mg/mL。相图中左上侧为微乳区（标记为ME）。如图1。

固定Km=1，选用空白水溶液与AR水溶液浓度分别为150 mg/mL、300 mg/mL、450 mg/mL绘制伪三元相图，结果见图2。

图1 Km值对微乳形成区域的影响Fig.1 Effect of Km to the microemulsion region

图2 AR浓度对微乳形成区域的影响Fig.2 Effect of the concentration of AR to the microemulsion region

由图1可见，在含药微乳中，随Km值由1/3到1/1，微乳形成区域逐渐增大，之后随着Km值的增加，微乳形成区域面积有减小的趋势，故确定Km=1；由图2可以看出，当Km=1时，含药微乳相图中的微乳形成区域随AR水溶液浓度增加而增大，均大于空白微乳，这可能与AR作为皂苷类成分具有一定的表面活性有关。当处方组成为：油相50%，混合表面活性剂35%，水相15%时，可形成外观均一，淡黄色澄清透明溶液。外标两点法测得高、中、低AR微乳的质量浓度分别为：2.08、1.09、0.55 mg/mL。

3.2 微乳理化性质

空白微乳与载药微乳的黏度分别为76 cp和76.2 cp；折光率为 1.439 0 和 1.434 8；平均粒径为10.7 nm和6.9 nm，经离心后各体系仍澄清透明，无分层现象。染色结果显示，苏丹红在微乳中的扩散速度明显快于亚甲基兰，可以判定为W/O型微乳。

3.3 AR微乳药效学研究结果

3.3.1 AR微乳对佐剂性关节炎原发病变小鼠体质量的影响 在给药过程中，5组小鼠的体质量呈上升的趋势，且AR微乳高，中，低剂量组，AR溶液组，白芍总苷组小鼠体质量与模型组相比均没有显著性差异，说明AR微乳、AR溶液、白芍总苷对发病小鼠的体质量无影响。

图3 AR微乳对佐剂性关节炎原发病变小鼠体质量的影响Fig.3 Effect of AR microemulsion on weight of primary AA mice

3.3.2 AR微乳对佐剂性关节炎原发病变小鼠足跖肿胀率的影响 在注射弗氏完全佐剂后，小鼠足跖肿胀率较注射前显著升高，表明AA小鼠原发病变模型建立成功。RA病理表现复杂多样，以关节的炎性肿胀、变形、滑膜增生、骨及软骨破坏为主［8］。因此，测量足跖肿胀度是本实验中判断AR药效学的重要依据。模型组在这7 d内足跖肿胀率呈上升的趋势，给药7 d内，这5种药物对小鼠足跖肿胀率无显著性差异，但是AR微乳高，中，低剂量及AR水溶液均能降低小鼠足跖肿胀率。

图4 AR微乳对佐剂性关节炎原发病变小鼠足跖肿胀率的影响Fig.4 Effect of AR microemulsion on swollen ratio of primary AA mice与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

3.3.3 AR微乳对佐剂性关节炎小鼠原发病变脏器指数的影响 AR微乳组、溶液组、白芍总苷组均不会引起小鼠胸腺指数，脾脏指数的变化，说明AR溶液与微乳均不会引起胸腺和脾脏的萎缩。

图5 AR微乳对佐剂性关节炎小鼠原发病变脏器指数的影响Fig.5 Effect of AR microemulsion on organ index of primary AA mice

3.3.4 AR微乳对佐剂性关节炎原发病变小鼠组织形态学的影响 从病理学测定结果也表明，5种药物组小鼠病变部位的组织形态好于模型组，说明这5种药物对佐剂性关节炎原发病变小鼠的关节有保护作用。AR微乳给药高剂量组形态与白芍总苷组较接近，改善佐剂性关节炎原发病变的程度为最好。而AR溶液组仍可见较多炎细胞浸润，说明在同等浓度下，AR微乳的效果较好。

图6 病理切片图Fig.6 Pathological picture15

4 讨论

卵磷脂具有良好的生物相容性和乳化能力，以卵磷脂/乙醇作为混合表面活性剂可与多种油相形成稳定的油包水微乳［9-11］，灵仙新苷（AR）作为皂苷类成分，具有一定的表面活性，其加入后提高了W/O微乳的形成区域，可以形成更高载药量的微乳。在伪三元相图中，Km=1∶1时微乳区域最大，可能由于Km＞1∶1时随着系统中卵磷脂量升高液晶区减小从而使微乳面积减小所致［12］。

AR由于其相对分子质量较大，水溶性较好，药物分子不易透过生物膜从而影响其生物利用度。油包水微乳可使药物脂溶性增强，粒径小，能够通过胃肠壁水化层直接与胃肠上皮细胞接触，促进药物吸收；此外口服后能够经淋巴吸收从而克服了肝脏首过效应，提高生物利用度。

本实验中采用白芍总苷（TGP）作为阳性对照药，对多种炎症性病理模型如大鼠佐剂性关节炎模型等具有明显的抗炎和免疫调节作用，其在多个环节影响细胞免疫、体液免疫及炎症过程，具有免疫调节、抗炎镇痛及保肝和保护血管内皮细胞等作用，为多种免疫性疾病的治疗提供了良好选择［13］。本研究表明AR微乳相比AR溶液对佐剂性关节炎原发病变小鼠可更好地改善其病理形态。但制剂促进药物吸收的机制并不是单一的，仍需进一步研究。

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The preparation and preliminary pharmacodynamics of clematichinenoside microemulsion

DONG Cai-xia1， LI Mo-ying1， YAO Lan1， LI Feng-wen1， LI Yun-man2， LIU Li-fang1

（1.Analysis Department of Chinese Medicine，China Pharmeceutical University，Nanjing 211198，China；2.Department of Pharmacology，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

AIMTo prepare homogeneous and stable water in oil（W/O）microemulsion，and evaluate its therapeutic effect to primary adjuvant arthritis mice，provide background of pharmacodynamics for clematichinenoside AR.METHODSTo use lecithin and ethanol as surfactant and cosurfactant，Labrafil M 1944Cs as the oil phase and AR solution as aqueous phase，determine the mass ratio of the components by pseudo-ternary phase diagram.Adjuvant arthritis（AA）model was established through intradermal injection of Freund＇s complete adjuvant（CFA）to right metaleg voix pedis of mice.To use the body weight，swelling rate，thymus and spleen index as the main detection index and to observe the morphology of the diseased region in mice to evaluate the difference among AR solution，AR microemulsion，and TGP which was used as the positive control drug.RESULTSThe formulation of AR microemulsion which was clear light yellow solution was as follows：Km=1 ∶1，50%oil，35%of mixed surfactants，aqueous 15%，with the mean particle size of 10.7 nm.The results showed AR microemulsion could improve the pathological lesion and the morphology in diseased region of primary AA mice.CONCLUSIONAR microemulsion，with smaller particle size and better liposolubility，is able to increase drug bioavailabilityin vivo，which shows that the microemulsion has broad application prospects as a new formulation of drugs.On the other hand，the mechanism of promoting drug absorption is not single and further study is still needed.

clematichinenoside；water in oil microemulsion；pharmacodynamics

book=7,ebook=343

R944.2+7

A

1001-1528（2011）07-1158-06

2010-11-15

国家自然科学基金（30772770）

董彩霞（1985—），女，硕士生，从事中药分析研究。

*通信作者：刘丽芳（1969—），女，博士，教授，主要从事中药活性成分和动物药研究。Tel：（025）86185373，E-mail：liulifang69@126.com