蝎素组分Ⅲ对 Jurkat细胞NF-кB通路的调节作用

赵永新， 宋向凤， 郭继强， 王 辉

(新乡医学院免疫学研究中心，河南新乡 453003)

蝎毒在中医治疗上，镇痛、抗惊厥、免疫调节、抗肿瘤等方面的实践已取得了很好的效果［1］。其中起主要药理作用的蝎毒组分Ⅲ是从河南马氏钳蝎毒中分离出的一种成分，对多种肿瘤细胞及细胞系有显著的细胞杀伤和细胞毒性作用［2－3］。研究资料表明蝎素具备细胞毒性作用的同时，还有重要的生物应答调节剂的作用，可显著增强小鼠的免疫功能，促进T淋巴细胞的转化和 TNF－a的分泌，使用药量显著减少并可增强其它抗肿瘤药物的效应。但关于蝎素对细胞免疫调节影响研究较少，SCVⅢ对T淋巴细胞免疫调节的机制尚不清楚。本研究以Jurkat细胞作为研究对象，观察 SVCⅢ对Jurkat细胞IKK1、IкBa mRNA表达的影响，以及对 Jurkat细胞中 NF－кB活化的影响，并探讨SVCⅢ参与细胞免疫调控的可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料 T淋巴细胞系Jurkat购自美国ATCC公司，TfxTM－50质粒由美国NIH栾好江博士惠赠。转染试剂TfxTM－50 Reagent、逆转录酶MMLV购自Promega公司产品，总RNA抽提试剂盒Rneasy Mini kit购自QIAGEN公司 ，SVC－Ⅲ由新乡医学院分析测试研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 Jurkat细胞复苏后用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基进行培养，细胞呈悬浮生长，聚集成团状为生长良好，每2～3 d换1次培养液。

1.2.2 瞬时转染与荧光素酶相对活性测定 按照TfxTM－50 Reagent(Promega)产品说明书进行操作。将质粒 NF－кB－Luc 和内对照 β－Gal转染 Jurkat细胞，转染5 h后加入终浓度为0、0.1 ng/mL、1.0 ng/mL、10 ng/mL和 100 ng/mL的 SVC－Ⅲ。48 h后将细胞收集于1.5 ml EP管，用0.01 mol/L pH7.2的PBS洗2次，加入200 μL裂解液，室温放置15 min，涡旋振荡混匀，12 000 r/min 4℃ 离心10 min，收取20 μL上清细胞裂解液放置于测定管中，加入100 μL荧光素酶反应底物，在荧光分析仪上测定荧光强度，检测时间为20 s。实验重复3次。

1.2.3 RT－PCR扩增IKK1、IкBa 将生长状态良好的Jurkat细胞离心收集，调整细胞浓度为5×106个/mL，分装于24孔培养板中，1 mL/孔，加入到终浓度为 0、0.1 ng/mL、1.0 ng/mL、10 ng/mL 和 100 ng/mL的SVC－Ⅲ。48 h后用QIAGEN总RNA抽提试剂盒提取Jurkat细胞总RNA，按说明进行操作。扩增所用基因引物:IKK1:上游:5′－GCAGAGAGGAGGACCTGTTG－3′，下游:5′－ACTGCTTCAGCCCACACTTT－3′，扩增产物为 438 bp;IкBa:上游:5′－AACCTGCAGCAGACTCCACT－3′，下 游:5′－ACACCAGGTCAGGATTTTGC－3′，扩增产物为 376bp;内参GAPDH:上游:5′－TTAGCACCCCTGGCCAAGG－3′，下游:5′－CTTACTCCTTGGAGGCCATG－3′，扩增产物为550bp。PCR反应条件为:95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30，循环36次，最后在72℃延伸5 min。同管在扩增到 24、28、32、36 循环时，分别取10 μL备用。取5 μL扩增产物电泳，用凝胶成像系统扫描。实验重复3次。

2 结果

2.1 NF－κB荧光素酶报告基因转染实验结果SVCⅢ浓度的逐渐增加(0.1 ng/mL、1.0 ng/mL)对Jurkat细胞 NF－κB的作用逐渐增强。浓度增加到1.0 ng/mL时，SVCⅢ对NF－κB的作用最强。随着SVCⅢ浓度的增加到一定浓度(10 ng/mL、100 ng/mL)，SVCⅢ对 Jurkat细胞 NF－κB 的作用减弱。

2.2 Jurkat细胞株中IKK1和IкBa mRNA的检测SVC－Ⅲ浓度的逐渐增加(0.1 ng/mL、1.0 ng/mL)对Jurkat细胞的IKK1和IкBa的表达作用逐渐增强。浓度增加到1.0 ng/mL时，SVCⅢ对IKK1和IкBa的mRNA的表达作用最强。随着SVCⅢ浓度的增加到一定浓度(10 ng/mL、100 ng/mL)，SVCⅢ对Jurkat细胞IKK1和IкBa的表达作用减弱。各组中随着循环的增加 IKK1、IкBa的mRNA表达是逐渐增强的。无SVCⅢ刺激，IкBa的表达强于IKK1;SVCⅢ(0.1、1.0、10、100 ng/mL)刺激组，IKK1 的表达强于 IкBa。见图 1 ～2。

图1 NF-κB荧光素酶报告基因转染实验结果Fig.1 NF-κB fluorescent element enzyme gene transfection experimental results

图2 不同浓度SVCⅢ刺激Jurkat细胞 IKK1、IкBa和GAPDH在24、28、32和36循环mRNA的表达Fig.2 The expression of different concentration SVCⅢstimulate IKK1，IкBa and GAPDH of 24，28，32 and 36 mRNA cycle in Jurkat cell

3 讨论

近年来，蝎素作为生物应答调节剂调节免疫系统功能的研究已引起广泛重视，我们以前的研究显示SVCⅢ能够促进T淋巴细胞的转化和肿瘤坏死因子的分泌［4］，能以剂量依赖的方式调节Jurkat细胞中信号分子ZAP－70和LAT的表达［5］。蝎毒多肽提取物可以改善荷瘤机体细胞免疫功能的抑制状态，增强其识别、杀伤突变细胞的能力，发挥抗肿瘤作用，肿瘤抑制率可达 55.21%［3］。

关于蝎素对细胞免疫功能的影响研究较少，SVC－Ⅲ对T淋巴细胞免疫功能的机制尚不完全清楚。Jurkat E6－1细胞是人类T淋巴肿瘤细胞的细胞株，在功能上与人类 T淋巴细胞有很多共同的特点，T淋巴瘤的激活与凋亡有很多种因素，在免疫调节中具有十分重要的作用机制，已广泛用于实验室研究。本研究以Jurkat E6－1细胞作为研究对象，观察不同浓度的SVC－Ⅲ对Jurkat细胞NF－кB信号通路的影响，以探讨SVC－Ⅲ抗肿瘤的作用，为抗肿瘤治疗寻求更加有效的方法。并探讨SVC－Ⅲ参与细胞免疫调控的可能机制。

本研究发现低剂量 SVC－Ⅲ(0.1 ng/mL、1.0 ng/mL)对Jurkat细胞 NF－кB活性及调空蛋白 IкBa及相关激酶IKK1mRNA的表达有一定促进作用，特别是在浓度为1.0 ng/mL时作用最强(P＜0.01)，而随着浓度增高作用开始逐渐减弱。NF－кB是一种细胞核转录因子，在调控免疫细胞的激活、淋巴细胞的发育、细胞凋亡、肿瘤形成、病毒复制、炎症反应及多种自身免疫性疾病方面发挥重要作用［6－8］。正常情况下NF－κB与NF－κB的内源性抑制因子主要是IκB抑制蛋白结合，以失活的形式存在胞浆中，当细胞接受刺激，IκB裂解，暴露出 NF－κB亚基上核定位序列和具有基因转录活性的反式激活域，NF－κB从胞浆移位入胞核，发挥基因转录调控的作用。IкBa 是细胞内 NF－κB 的主要抑制因子，细胞内 IкBa的水平、IкBa受信号刺激后能否正常磷酸化进而降解对 NF－κB 活化起关键作用［9－10］，而 IкBa 的磷酸化受IκB激酶(IKK)的调节。IKK1可使 NF－кB抑制蛋白IкB被磷酸化，通过泛素降解途径使 IкB由NF－кB 二聚体上解聚，从而激活了 NF－кB，进而调控靶基因的转录。一些体内外的实验研究表明，NF－кB在乳腺癌中异常激活，抑制乳腺癌细胞NF－кB的活性可引起肿瘤细胞的凋亡，从而抑制乳腺癌细胞生长［11］。从本实验中可以看出高剂量的可以通过IKK1 抑制 IкBa 的磷酸化，IкBa 不能从 NF－кB 二聚体上解聚，NF－κB未能被激活，不能调控靶基因的转录。SVC－Ⅲ通过抑制NF－кB活性的作用，可以阻断NF－κB信号通路抑制细胞增殖，使肿瘤细胞的生长受到抑制。

以上研究结果表明高浓度SVC－Ⅲ可抑制Jurkat细胞IкBa蛋白的磷酸化，抑制NF－κB途径的激活，从而阻断NF－κB 信号通路IKK1、IкBa表达，进而诱导细胞周期阻滞、抑制肿瘤细胞增殖。可见对NF－κB的深入研究为抗肿瘤治疗提供了新的、更为有效的作用靶点，为临床癌症病人的治疗提供了一种有效的治疗手段。

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