化学去细胞异体神经移植修复鼠全面神经的实验研究

赵 斌，杨 昱，詹胜锋，彭 江，王 玉，赵 喆，任志午，张 莉，许文静，卢世璧

(中国人民解放军总医院，北京100853)

化学去细胞同种异体神经(CEAN)最大限度去除了免疫原性物质，同时较完好地保存了神经内部结构和细胞外基质的活性成分，可作为自体神经移植的替代材料。然而，前期研究［1，2］局限于单根单支周围神经的长度，对于复杂部位的周围神经缺损的修复，如具有丛状结构的臂丛神经缺损、“一主干多分支”的神经(如尺神经手部分支、面神经)缺损，国内外鲜有报道。本研究尝试运用化学萃取法处理大鼠全面神经，修复大鼠全面神经10 mm缺损，探讨CEAN修复特殊部位周围神经缺损的效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂、设备 成年SD大鼠40只，体质量(250±20)g，由解放军总医院实验动物中心提供。Triton X-100液、脱氧胆酸钠、荧光金、快蓝(美国Sigma公司)，爱德华牌TSJ-1A型自动组织脱水机(天津天利航空机电公司)，BMJ-1型组织包埋机(天津天利航空机电公司)，Leitz 1516型组织切片机(德国Leica公司)，BH-2 OLYMPUS生物显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.2 化学去细胞同种异体面神经制备 取5只SD大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，无菌条件下取双侧面神经，长约15 mm，去除神经周围外膜，采用0.4%脱氧胆酸钠与0.3%Triton X-100处理坐骨神经制备CEAN，60Co辐照1 h，置于2 ml PBS液(pH 7.4)4℃储存备用。

1.3 自体面神经冻融处理 在无菌条件下取5只SD大鼠双侧面神经，将切断的全面神经放入装有10%甘油冻存管，纱布包裹后放入液氮3 min，再将冻存管于37℃水浴3 min，取出面神经，生理盐水冲洗后4℃储存备用。

1.4 面神经缺损动物模型制备及分组 取30只SD大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，无菌条件下显露左侧面神经主干及5个分支，近端切断面神经主干，从该断点至各分支10 mm处切断各分支，造成各分支10 mm的缺损。将大鼠随机分为A、B、C 3组(n=10)，即自体全面神经移植组(A组)、化学去细胞同种异体全面神经移植(CEANA)组(B组)和自体全面神经经液氮冻融后回植组(C组)，各组分笼饲养。

1.5 观测指标

1.5.1 去细胞程度观察 分别切取上述化学去细胞同种异体全面神经、正常大鼠全面神经和冻融处理后自体面神经的主干及5个分支(颞支、颧支、颊支、下颌缘支、颈支)，各约2 mm。神经标本行横向冰冻切片，片厚10μm。切片室温放置30 min后入4℃丙酮固定10 min。PBS液洗5 min×3次。滴加Hochest-33258荧光染料，染色5 min。PBS液洗5 min×3次，甘油封片，荧光显微镜下观察、比较神经内细胞的残留情况及保留结构程度。

1.5.2 术后一般情况和功能评价 观察术后大鼠精神状态、伤口情况、面部皮肤色泽、面部表情是否左右对称、眼裂大小、触须动度等。

1.5.3 免疫荧光染色 术后12周，SD大鼠麻醉后取出左侧面神经，分别切取移植物的主干及5个分支末端2 mm的神经组织，垂直于神经轴向切片，片厚5μm，每段神经切2张切片，对切片进行神经纤维细丝蛋白(NF200)和神经生长因子受体(P75)的免疫荧光染色，切片室温放置30 min，入4℃丙酮溶液固定10 min后，PBS液洗5 min×3次。3%H O孵育5～10 min。蒸馏水冲洗，PBS液浸泡5 min。滴加NF200鼠抗人一抗(1∶200)，4℃过夜。PBS液洗5 min×3次。滴加FITC(1∶100，绿色)标记抗鼠IgG，避光40 min。PBS液洗5 min×3次。滴加P75兔抗人一抗(1∶200)，37℃ 1 h，PBS液洗5 min×3次。滴加TRITC(1∶100，红色)标记抗兔IgG稀释，避光40 min。PBS液洗5 min×3次，封片，荧光显微镜下观察神经横截面上神经纤维和雪旺细胞的生长情况。

2 结果

2.1 CEAN大鼠全面神经形态和组织学观察 大体观察可见化学去细胞同种异体全面神经长度较之前缩短，外膜光滑，略通透，质地较韧。Hochest-33258荧光染色后，可见萃取前新鲜大鼠面神经内有大量细胞存在，其细胞核被荧光染料染成蓝色;而CEAN内，蓝色亮点几乎不可见，即细胞去除干净，CEAN结构完整。而液氮冻融后面神经内可见大量细胞碎片，神经结构破坏严重。

2.2 术后一般情况和功能评价 术后3 d，各组大鼠精神状态良好，伤口处稍红肿，伤口干燥，无血性及脓性分泌物。静息状态下面部表情不对称，鼻尖歪向健侧(右侧);活动状态下术侧(左侧)触须动度明显弱于健侧。且各组大鼠间无明显差异。术后12周，静息状态下大鼠面部表情左右对称，无明显歪斜;活动状态下，两侧触须动度基本一致。

2.3 再生神经的大体形态 术后12周取材，观察到自体面神经移植组神经组织与周围组织轻微粘连，有少量瘢痕形成;移植物及远、近段神经呈正常外观，白色较韧，有光泽，无萎缩;神经吻合口无膨大，连续性良好。CEANA组和冻融组神经组织与周围组织粘连较重，但较易分离，少量瘢痕形成;吻合口处稍膨大，移植物与两端受体神经粗细一致，颜色相近，质地较韧。

2.4 免疫荧光染色 NF200和P75免疫荧光染色可见3组移植的全面神经其5个分支远端均有大量新生的神经纤维和大量新生的梭形雪旺细胞，部分新生的神经纤维周围包绕新生的雪旺细胞。各组大鼠间无明显差异。术后12周，A组、B组有髓神经纤维总数均优于C组(P＜0.05)，A组与B组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 术后12周各组大鼠面神经各支有髓神经纤维计数(±s)

表1 术后12周各组大鼠面神经各支有髓神经纤维计数(±s)

注:与 A 组比较，*P ＜0.05;与 B 组比较，△P ＜0.05

组别 主干 颞支 颧支 颊支 下颌缘 颈支A组 2 309±246 1 501±130 1 664±124 2 025±150 1 876±911 401±121 B组 2 223±224* 1 374±124* 1 651±113* 2 015±158* 1 769±131* 1 298±89*C组 2 031±179＊△ 1 363±158＊△ 1 554±87＊△ 1 862±159＊△ 1 757±137＊△ 1 303±72＊△

3 讨论

对于特殊部位具有特殊结构的周围神经，如面神经“一主干五分支”结构，难以找到自体能够匹配的供体神经，而异种神经存在较强的排斥反应。另外，目前利用组织工程的方法还无法做出“一主干五分支”且与缺损相匹配的结构［3］。同种异体神经的出现解决了以上难题，而且保留了神经的独特结构，其天然的仿生性是其他任何移植替代材料所无法比拟的。

本研究结果显示，CEANA结构保存完整，而液氮冻融后结构破坏严重。证实了冻融法虽然能杀死细胞、去除免疫原性，但不能清除细胞碎片，且引起基底膜碎裂。由于细胞碎片的存在，在修复过程中巨噬细胞和雪旺氏细胞侵入基底膜管进行吞噬，这种细胞侵入在神经再生的早期起阻碍作用，且进一步破坏基底膜［4］。

化学萃取法主要是使用各种化学去污剂破坏掉雪旺细胞和髓鞘，并清除细胞碎片及髓鞘的残留物，保留神经外膜、束膜和内膜形成的管柱状结构和雪旺细胞基底板层及其主要成分［5］，具有其他替代材料无法比拟的优越性，成为修复周围神经缺损理想材料之一，体现出此种结构的同种异体神经的独一无二性，其内部天然的基底膜特殊结构，比单根单支周围神经的基底膜结构更为复杂，且在神经损伤后再生的过程中，对于基底膜的完整性要求更高，而传统的物理去除免疫原性方法，对单根单支周围神经的基底膜结构破坏都很严重，更难达到此种特殊结构周围神经的“高标准”，势必遭到淘汰。

本研究中术后12周结果显示，3组再生的面神经均由主干沿着“一主干五分支”的特殊结构顺利通过10 mm的缺损，成功长入终末靶器官。且CEANA组再生有髓神经纤维计数明显优于自体面神经液氮冻融后回植组的修复效果。

总之，CEANA对于特殊部位具有特殊“一主干多分支”结构的周围神经而言，是其他任何移植材料都无法比拟和替代的，在今后临床复杂的周围神经损伤病例中，CEANA的优越性将逐步体现，最终得到广泛应用。

［1］Yu H，Peng J，Guo Q，et al.Improvement of peripheral nerve regeneration in acellular nerve grafts with local released of nerve growth factor［J］.Microsurgery，2009，29(4):330-336.

［2］Li Z，Peng J，Wang G，et al.Effects of local release of hepatocyte growth factor on peripheral nerve regeneration in acellular nerve grafts［J］.Exp Neurol，2008，214(1):47-54.

［3］Hudson TW，Evans GR，Schmidt CE.Engineering strategies for peripheral nerve repair［J］.Orthop Clin North Am，2000，31(3):485-498.

［4］王冠军，孙明学，卢世璧，等.改良化学去细胞同种异体神经制备方法的实验研究［J］.中国矫形外科杂志，2007，15(12):929-932.

［5］孙明学，王鑫，赵斌，等.化学去细胞法对粗大神经质量评价方法及影响因素的探讨［J］.中国修复重建外科杂志，2008，22(11):1373-1377.