脂联素基因多态性与老年人冠心病相关性研究

张艳梅，杨雨旸，孙 尧

(1河北联合大学，河北唐山063000;2河北联合大学附属医院)

已有研究［1，2］证实脂联素水平与冠心病密切相关，因其与糖尿病和心血管病的潜在联系，其基因多态性近年来受到广泛关注。其中研究的热点集中在+45T/G和+276G/T单核苷酸多态性(SNP)位点，但研究结果因样本量、年龄、种族差异，不尽相同。2008年8月～2010年8月，我们通过对河北唐山地区冠心病及非冠心病的老年人脂联素基因(APM-1)第2外显子+45位点基因型的分布情况进行大样本调查，探讨脂联素SNP+45G/T与老年冠心病的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 病例组选择河北联合大学附属医院老年病科住院患者149例，均确诊为冠心病，其中男99例、女50例，年龄65～89(77±12)岁。经冠状动脉造影证实主要动脉(左前降支、左回旋支、右冠状动脉)中至少有1支内径狭窄＞50%，同时排除糖尿病。对照组为通过体检确定为未患有冠心病、糖尿病的正常健康人167例，其中男111例、女56例，年龄64～84(74±10)岁。所有受试对象彼此之间无血缘关系，有近期服药史者、患有严重的肝肾疾病者均排除本研究之外。两组间年龄、性别构成比相匹配。样本采集遵循“知情同意”原则。

1.2 样本采集 所有研究对象采集空腹静脉血5 ml，其中3 ml分离血清用于生化指标测定，2 m l用于基因组DNA提取。同时测量身高、体质量、腹围、臀围等。

1.3 聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法 采用苯酚—氯仿法提取基因组DNA。参照GenBank中APM序列自行设计一对扩增引物。5'-GCAGCTCCTAGAAAGTAGACTCTGCTG-3'，反向引物为 5'-GCAGGTCTGTGATGAAAGAGGCC-3'。扩增的目的片段长度为372 bp。PCR反应条件为:95℃预变性2 min后，95℃变性30 s，56℃退火40 s，72℃延伸40 s，共完成30个循环，72℃终末延伸7 min。产物经2%的琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙啶)60 V恒压电泳30 min，紫外透射仪观察结果后，置冰箱－4℃保存。PCR扩增产物酶切:限制性酶切反应在20μl体系中进行，其中包括10μl PCR扩增产物，10 U/μl SmaⅠ限制性内切酶3 U(MBI)及 Bufer 2 μl(MBI)，总体系 20 μl，轻轻混匀后置于37℃恒温水浴箱中消化4～6 h。酶切后电泳。DNA序列分析:随机抽取不同长度的PCR产物，进行核苷酸序列测定(上海生工测序部)。

1.4 统计学方法 采用Excel和SPSS12.0软件进行统计学分析。正态分布的统计数据均以±s表示。组间差异采用χ2检验和单因素方差分析，用LSD方法进行两两比较。以P≤0.05为有统计学差异。基因型频率的观察值与预期值比较用Hardy Weinberg(H-W)平衡检验。

2 结果

2.1 一般资料比较 见表1。

2.2 PCR扩增产物 经SmaⅠ酶切电泳后产生3种基因型，野生型(T/T)显示1条带(372 bp)，杂合子型(T/G)显示 3 条带(372、209、163 bp)，纯合子突变型(G/G)显示2条带(209、163 bp)。

表1 病例组与对照组一般临床资料比较(±s)

表1 病例组与对照组一般临床资料比较(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

组别 BMI(kg/m2) SBP(mmHg) DBP(mmHg) TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)病例组 24.41 ±2.37 135.17 ±20.76* 82.49 ±10.78 5.12 ±1.01* 2.26 ±1.25* 0.97 ±0.32 3.01 ±0.79*对照组 23.89 ±2.68 124.99 ±17.90 79.94 ±10.58 4.30 ±0.63 1.52 ±0.94 0.87 ±0.20 1.87 ±0.61

2.3 等位基因和基因型频率比较 对各组基因型频率进行平衡检验，均符合H-W遗传平衡，故认为能够代表群体的基因分布。SNP+45(T/G)的3种基因型频率在病例组和对照组间的分布有统计学差异(χ2=7.917，P=0.019)，2 种等位基因频率在两组间的分布也有统计学差异(χ2=5.057，P=0.025)。见表 2。

表2 APM-1基因+45位点等位基因及基因型频率的比较［例(%)］

3 讨论

脂联素是新近发现的由脂肪组织特异性分泌的蛋白质。人类APM-1是单拷贝基因，全长约17 kb，包括3个外显子和2个内含子，定位于染色体3q27，此区域存在2型糖尿病、代谢综合征和冠心病的易感位点［3～5］，因此针对于SNPs与疾病相关性的研究已经成为近年来的热点。

目前已明确APM-1多态性与肥胖、2型糖尿病、胰岛素抵抗等有一定的相关性，但与冠心病的相关性研究报道较少。有研究显示SNP+45与血浆脂联素水平无相关性，与胰岛素抵抗密切相关，携带G/G基因型的人群发生2型糖尿病的危险性增加［6，7］。国外有研究显示SNP+45位点多态性与冠心病显著相关，并且独立于传统的冠心病危险因素［8］。本研究结果显示，唐山地区老年冠心病患者SNP+45位点G/G基因型明显多于对照人群，等位基因分布分析提示G等位基因在冠心病病人群中多见，提示携带SNP+45G/G基因型的个体更易发展为冠心病。脂联素基因SNP+45多态性为同义突变，虽然这个SNP并没有引起氨基酸序列的变化，推测该位点可能与一个致病变异呈高度连锁不平衡，所以此处核苷酸序列的改变影响了蛋白质表达的效率。另外我们还发现老年冠心病组SBP、TC、TG和LDL-C水平显著增高，提示冠心病与环境因素相关，与以往研究相符。

本研究从一定角度揭示了APM-1与唐山地区老年冠心病的关系，但冠心病为多因素、多基因性疾病，单个基因的作用有限，基因研究可因病例的入选标准、样本量及研究对象不同，结果有所不同。因此，有必要扩大研究对象数量以及开展对不同种族的研究。

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