乳腺癌组织中HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax表达的临床意义

杨黎，朱霞，常建英，冉立（贵州省肿瘤医院乳腺妇瘤科，贵阳市 550000）

细胞周期调控机制的失衡导致细胞分化、凋亡的变化，从而肿瘤细胞不断增殖形成了侵袭、转移的基础。研究细胞增殖、凋亡中的一系列分子事件变化，并结合临床预后因素，可能将直接地指导肿瘤的诊断，确定个体化治疗手段以及揭示肿瘤预后的内在生物学特征。本文检测原癌基因人表皮生长因子受体2（HER-2）、细胞增殖标志物增殖细胞核抗原（PCNA）和凋亡相关基因Bcl-2、Bax在乳腺癌组织中的表达，分析其与临床病理因素的关系，探讨HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax表达作为判断乳腺癌生物学行为和预后指标的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床标本

50例乳腺癌根治术后标本来自我院1997年收治的HE染色病理确诊的女性患者，所有病例术前未接受化疗和放疗。标本用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋为存档蜡块。患者年龄31～68岁，中位年龄45岁；浸润性导管癌46例，浸润小叶癌2例，粘液癌1例，印戒细胞癌1例；腋淋巴结转移者28例，无淋巴结转移者22例；临床分期Ⅰ期2例，Ⅱ期32例，Ⅲ期14例，Ⅳ期2例。

1.2 试剂

HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax蛋白的检测一抗均为鼠抗人单克隆抗体；免疫组化Envision二步法试剂盒，购自北京中山生物技术有限公司。

1.3 免疫组化方法

存档蜡块连续切片，脱蜡再浸泡于梯度乙醇水化；3%过氧化氢孵育，以阻断内源性过氧化物酶；微波抗原热修复；滴加一抗，37℃孵育1～2 h，TBS冲洗；滴加非免疫性血清，37℃孵育20 min，TBS冲洗；滴加Envision二抗，37℃孵育20～30 min，TBS冲洗；显色，冲洗、复染、脱水、封片。

1.4 结果判断

HER-2阳性染色位于细胞膜，呈棕黄色染色，按Hercep Test标准评分[1]。0级:浸润性肿瘤细胞无染色；1级:任何比例浸润性肿瘤细胞呈弱且不完整的细胞膜染色或少于10%的肿瘤细胞呈弱且完整的细胞膜染色；2级:大于10%的肿瘤细胞呈弱或不一致的完整的细胞膜染色或小于30%的肿瘤细胞呈现强且完整的细胞膜染色；3级:大于30%的浸润性肿瘤细胞呈强且完整的细胞膜染色。评估其蛋白表达状况为:0级、1级为阴性，2级为不确定，3级为阳性。PCNA阳性染色位于细胞核，Bcl-2阳性染色位于细胞浆，Bax阳性染色位于细胞浆。阳性细胞染色为棕黄色或棕褐色，评估标准为:“－”为无阳性细胞；“+”为＜25%阳性细胞；“++”为25%～50%阳性细胞；“+++”为＞50%阳性细胞。

1.5 统计学处理

以SPSS 13.0软件包对数据进行统计分析，采用χ2检验、校正的χ2检验或确切概率法，各指标的相关分析用Spearman相关性检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表达情况

乳腺癌组织中HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax的表达见图1，其中HER-2表达率为44%（22/50），PCNA表达率为82%（41/50），Bcl-2表达率为48%（24/50），Bax表达率为54%（27/50）。

图1 HER-2（A）、PCNA（B）、Bcl-2（C）、Bax（D）在乳腺癌组织中的表达（Envision×200）Fig 1 The expression of HER-2（A），PCNA（B），Bcl-2（C），and Bax（D）in breast cancer tissue（Envision ×200）

2.2 乳腺癌HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax表达与临床病理因素之间的关系

因50例乳腺癌病理类型中浸润性导管癌占绝大多数，其他类型例数少，故未作统计分析。Ⅰ、Ⅳ期病例各2例，故将Ⅰ、Ⅱ期合并，Ⅲ、Ⅳ期合并。乳腺癌组织中HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax的表达与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移状态和临床分期的关系如表1所示。

表1 HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax阳性表达与临床病理因素之间的关系Tab 1 Relation between HER-2，PCNA，Bcl-2 and Bax expression and clinicopathological factors

HER-2在淋巴结转移组的阳性表达率为57.1%，高于无淋巴结转移组的27.3%（P＜0.05）；在Ⅲ～Ⅳ期的阳性表达率为62.5%，高于Ⅰ～Ⅱ期的35.3%，差异无统计学意义，但卡方值接近临界值，在进行数据分析时可有趋向性。

PCNA与肿瘤大小明显相关，在肿瘤直径≥4 cm的患者中阳性表达率高达96.6%，在＜4 cm组阳性表达率为61.9%（P＜0.01）。

Bcl-2与年龄、肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期无关。

Bax在淋巴结转移组的阳性表达率为67.9%，无淋巴结转移组为36.4%，差异有统计学意义（P＜0.05）；在Ⅲ～Ⅳ期组的阳性表达率为75.0%，高于Ⅰ～Ⅱ期组的44.1%（P＜0.05）。

2.3 乳腺癌HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax表达与淋巴结转移状况的相关分析

经Spearman等级相关性检验，与淋巴结转移相关的指标有HER-2、Bax，且呈正相关（相关系数均为0.284，P＜0.05），进一步验证了上面的结果；Bcl-2与淋巴结转移的相关系数为负值，但差异无统计学意义。

3 讨论

HER-2是一种原癌基因，编码P185跨膜蛋白，是表皮生长因子受体家族成员之一，具有酪氨酸激酶活性，激活后可传导致分裂信号。HER-2癌基因的激活方式表现为基因扩增与蛋白过表达。文献报道[2，3]，免疫组化技术（IHC）检测HER-2表达率在10%～54%之间。采用IHC与直接基因检测水平的荧光原位杂交（FISH）方法相比，检测符合率达96%[4]。本课题采用临床最常用的IHC检测HER-2基因在细胞表面的蛋白表达水平，其表达率为44%。大多数研究已表明[5，6]，HER-2的改变与乳腺癌的不良预后有关，HER-2阳性者肿瘤的恶性程度较高、激素受体水平较低、肿瘤较大、多有淋巴结转移、总生存期较短，而且一旦病情复发，HER-2阳性者对激素和化疗的反应率均很低，因而HER-2又可作为对激素或化疗有否反应的预示指标。HER-2表达增高与临床病理因素关系的研究较多，但结果不尽一致。在本研究中，有淋巴结转移的病例中HER-2表达率显著高于无淋巴结转移病例，相关分析亦提示HER-2与淋巴结转移呈正相关；另外，临床分期晚的病例显示出HER-2表达率高的倾向性。专门针对HER-2阳性乳腺癌的分子靶向药物——曲妥珠单抗，就是以肿瘤细胞表面的HER-2为靶点，通过阻断HER-2引导的细胞信号通路，从而抑制肿瘤细胞的生长。目前美国国家综合癌症网（NCCN）和中国版cNCCN指南已将其推荐为HER-2阳性乳腺癌患者的标准治疗。与传统化疗相比较，曲妥珠单抗只靶向作用于肿瘤细胞而避免杀伤正常细胞，因此不会产生严重的恶心、呕吐、贫血、脱发等不良反应。

PCNA又称周期蛋白，是DNA聚合酶的辅助蛋白，作用于DNA合成过程，特别是G1晚期与S期，是判定细胞增殖活性的内源性标志物，已证实PCNA的合成和表达与细胞增殖状态相关，即PCNA表达越高，细胞增生越活跃[7]。研究表明，PCNA与乳腺癌的分期、疗效、预后有密切的关系[8，9]。本组资料PCNA的表达率为82%，PCNA表达者肿瘤组织体积较大。PCNA在淋巴结转移及临床分期晚的病例中有高表达的趋势，但无明显差异性。分析原因，一是本组病例数较少，可能没有很好地反映PCNA与淋巴结转移的相关性；二是可能PCNA只代表肿瘤细胞增殖活性而不代表肿瘤组织的侵袭性。因此，PCNA与乳腺癌转移是否有关，仍需作进一步的研究。

肿瘤的发生和发展不仅取决于细胞的增殖率，也取决于细胞的凋亡率。Bcl-2和Bax已知是一对作用相反的凋亡抑制基因和促进基因，Bcl-2基因表达往往与好的生物学特性相关[10，11]。本组资料以往的研究结果显示[12]，通过多因素COX模型分析Bcl-2可作为判断乳腺癌生存期长短的指标，Bcl-2表达预示患者生存期较长。然而，在本研究中Bcl-2与肿瘤大小、分期及淋巴结转移等临床病理因素均无关，这可能是单因素分析中未控制其他因素对乳腺癌原发灶大小和淋巴结转移的影响，故未体现Bcl-2表达的统计学意义。本研究显示，Bax表达与淋巴结转移及临床分期晚有关，表明了Bax与不良的生物学特性相关，结论与当前的多数研究一致[13]。

随着分子生物学的发展，从基因水平探讨乳腺癌发生、发展的规律，已成为近年来研究的热点。临床上早期将具有高危因素及潜在转移危险的乳腺癌患者筛选出来，进行针对性的治疗是提高乳腺癌生存率、减少复发和转移的关键。本研究结果表明，HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax可作为判断乳腺癌预后的可靠指标，联合检测多个预后因子，全面判断患者的预后，早期筛选出具有高危因素的患者，给予积极治疗，将在很大程度上提高患者的术后生存率。

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