复方肠泰体外抗大肠癌活性的有效部位筛选

许珍珍，姚 楠（江苏省中医药研究院，南京市 210028）

大肠癌（Colorectal cancer，CRC）是包括从盲肠至直肠的整个肠段的癌肿，是常见的恶性肿瘤，其发病率占西方国家癌症发病率的第二位；在中国，大肠癌的发病率近来有上升的趋势，在恶性肿瘤中已排在第四位[1]。复方肠泰是江苏省中西医结合医院肿瘤科的临床验方，临床实践中显示出对大肠癌良好的抑制作用。多年治疗数据显示，该药有着稳定和可靠的疗效，可降低血黏度，提高患者的免疫功能，从而有效地防止大肠癌术后的复发和转移，提高患者的生存质量。

复方肠泰是根据大肠癌的病机特点，依据健脾活血解毒法配伍而成，主要由薏苡仁、白花蛇舌草、莪术、人参、党参、三七等药组成。其中薏苡仁健脾利水、扶正补益为君药，白花蛇舌草等清热解毒、消痈散结为臣药，莪术、三七活血化瘀、消肿止痛共为佐药，人参、党参补中益气、扶正解毒为使药。

笔者以系统溶剂萃取法提取复方肠泰的各个溶剂部位，结合体外细胞模型筛选出其抗大肠癌的有效部位，以期为复方肠泰抗大肠癌物质基础研究提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

cell 150型CO2恒温细胞培养箱（德国Hera公司）；classⅡtype A2型生物安全柜（美国Labconco公司）；Axio observer A型倒置相差显微镜（德国Zeiss公司）；Multiskan Spectrum型酶标仪（美国Thermo公司）；MH-1403型平板振荡器（海门其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.2 试药

各药材由笔者购买并鉴定为真品；RPMI-1640培养基、DMEM培养基（美国Gibco公司）；小牛血清（民海生物工程有限公司）；MTT、胰酶（美国Amresco公司）；二甲亚砜（分析纯，天津博迪化工有限公司）；氟尿嘧啶（天津金耀氨基酸有限公司）。

1.3 细胞株

人结肠癌细胞（SW480）购自中科院上海细胞所。

2 方法[2～7]

2.1 细胞的培养

按常规方法进行培养。即用含10%胎牛血清、100µg·mL-1青霉素、100 µg·mL-1链霉素的 RPMI 1640 培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞换液时间为2～3 d，3～5 d传代，传代前以0.25%胰蛋白酶消化2～5min。取对数生长期细胞用于试验。

2.2 溶液的提取

复方肠泰处方由人参、薏苡仁、莪术、白花蛇舌草等中药材组成。复方肠泰浓缩液制备方法:薏苡仁、莪术用85%乙醇回流提取2次，提取液挥发去乙醇；以上药渣与其余药材加水煎煮2次，合并乙醇提取液和煎煮液，浓缩至含生药2.50 g·mL-1。

将上述复方肠泰浓缩液分散于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取物挥去溶剂，分别得到复方肠泰石油醚部位、复方肠泰乙酸乙酯部位、复方肠泰正丁醇部位。用时分别取复方肠泰浓缩液和各部位溶解，使样品液浓度均为含生药1 g·mL-1。

2.3 复方肠泰各组药物及阳性药的加药前处理

取复方肠泰浓缩液、复方肠泰石油醚部位、复方肠泰乙酸乙酯部位和复方肠泰正丁醇部位，加入一定量PBS，超声30min，10000 r·min-1离心10min，取上清液，PBS稀释，0.22 μm滤器过滤除菌，4℃贮藏，备用。阳性对照药氟尿嘧啶用PBS稀释为 500μg·mL-1。

2.4 复方肠泰浓缩液及各部位萃取部分对结肠癌细胞的细胞增殖抑制作用（MTT法）

取对数生长期大肠癌细胞，常规胰酶消化制成单细胞悬液，并以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液稀释至5×104个·mL-1，接种于 96 孔板上，每孔0.1mL。置 37 ℃、5%CO2培养箱中培养24h后，弃原培养液，加入10μL各组复方肠泰药物与90μL RPMI 1640培养液。另设阴性对照组，加入10μL溶剂与90μL RPMI 1640培养液。每组设置6个复孔。作用48 h 后，每孔加 MTT 10μL（5mg·mL-1）继续培养 4 h ，小心吸去上清，加入DMSO 100μL，轻轻振荡10min后用酶标仪进行测定，测定波长为570 nm，参比波长为690 nm，重复3次。按下式计算抑制率:抑制率（%）＝（对照孔A值－给药孔A值）/对照孔A值×100%。

3 结果

不同极性部位对结肠癌细胞SW480的增殖抑制率分别见表1、表2、表3；不同极性部位对结肠癌细胞SW480增殖抑制的比较见图1。

表1 不同极性部位对结肠癌细胞SW480的增殖抑制率（高剂量）Tab 1 Inhibition ratio of different polarity parts on generation of SW480 cell（high-dose）

表2 不同极性部位对结肠癌细胞SW480的增殖抑制率（中剂量）Tab 2 Inhibition ratio of different polarity parts on generation of SW480 cell（medium-dose）

表3 不同极性部位对结肠癌细胞SW480的增殖抑制率（低剂量）Tab 3 Inhibition ratio of different polarity parts on generation of SW480 cell（low-dose）

图1 不同极性部位对结肠癌细胞SW480增殖抑制的比较Fig 1 Inhibition of different polarity parts on generation of SW480 cell

由表1～表3和图1可知，复方肠泰浓缩液对人结肠癌细胞SW480作用48 h后，2.5、5、10mg·mL-1复方肠泰浓缩液均能够显著抑制结肠癌细胞SW480的增殖，与阴性对照组比较，其抑制率分别为39.90%、74.37%、93.00%，呈现一定的量-效关系。进一步考察了复方肠泰浓缩液不同萃取部位的抗肿瘤活性，从抑制率看，石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取部位抗肿瘤活性存在差异。正丁醇部位对结肠癌细胞的抑制率较高，其抑制率分别依次为34.40%、52.50%、93.83%。由此可初步确定复方肠泰抗肿瘤有效部位为正丁醇部位。

4 讨论

本文通过体外试验初步筛选出复方肠泰抗大肠癌的有效部位，并初步探索了复方肠泰中活性部位-药效之间的关系。在后续试验中通过研究复方肠泰正丁醇部位高、中、低剂量组对H22荷瘤小鼠瘤重、免疫器官湿重以及溶血素抗体生成的影响，来验证其对H22荷瘤小鼠免疫功能产生的影响。结果表明，复方肠泰在抑制瘤重方面能与化疗药注射用环磷酰胺构成协同作用；在免疫方面能明显改善环磷酰胺化疗H22荷瘤小鼠所致脏器萎缩，提高胸腺和脾脏系数，增强其机体免疫功能；并且能够升高H22荷瘤小鼠血清溶血素水平，使环磷酸胺所致的血清溶血素含量下降有明显恢复，提高H22荷瘤小鼠的体液免疫能力。

笔者在以后的研究中，将会建立复方肠泰活性部位的指纹图谱，探索复方肠泰中活性部位-药效-指纹图谱之间的关系，进一步探讨其抗大肠癌的物质基础，为创制治疗大肠癌中药新药工作提供理论依据。

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