正交试验优化补肾健骨片中青风藤的提取工艺

张爱丽，易文斌（1.江苏联合职业技术学院连云港中医药分院，连云港市 222006；2.南京理工大学，南京市 210094）

补肾健骨颗粒为江苏联合职业技术学院连云港中医药分院附属医院制剂，由淫羊藿、青风藤、茯苓等多味中药组成，具有补肾壮骨、益气活血功效。主要适用于中老年患者，需长期服用。原剂型存在服用药量大、颗粒易吸潮结块等缺点，故笔者拟将颗粒剂改为片剂，以便于临床应用。在分析药材性质的基础上，对处方中淫羊藿、黄芪、茯苓等药材采用水提取法[1]；对处方中青风藤采用乙醇提取。为了尽可能地提取有效成分青藤碱，本次试验对乙醇提取的不同方法进行优选；并以青藤碱含量为指标，采用正交试验法考察了乙醇浓度、乙醇用量、pH值、药材粒度4个因素对有效成分的影响，以期得到良好的乙醇连续渗漉提取效果，为该制剂的工业化生产提供合理依据。

1 仪器与试药

SLG-500型连续渗漉提取罐（常州宇通干燥设备有限公司）；1100型高效液相色谱（HPLC）仪（美国Agilent公司）；KQ-250B型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；微孔滤膜、真空泵抽滤装置（天津奥特塞恩斯仪器有限公司）；AB204-S分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

青风藤药材购自江苏联合职业技术学院连云港中医药分院中药饮片厂，经连云港中医药高等职业技术学校杨成俊副教授鉴定为真品；青藤碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号:0774-200206）；甲醇为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 青藤碱含量测定[2]

2.1.1 色谱条件色谱柱:ODS-C18（钻石）（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相:甲醇-0.005 mol·L-1磷酸二氢钠缓冲液（以1%乙二胺调节pH 9.0＝55∶45；流速:1.0mL·min-1；柱温:30 ℃；检测波长:262 nm；进样量:10μL。理论板数按青藤碱峰计算不低于1500。色谱见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备 取青藤碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含1.25mg的溶液，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 称取处方量的青风藤药材，分别按正交试验安排制备，所得样品溶液减压浓缩，定容至100mL量瓶中，精密吸取0.1mL至100mL量瓶中，加相应浓度乙醇稀释，定容，即得。

2.1.4 标准曲线的制备 精密吸取青藤碱对照品溶液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释，摇匀。按“2.1.1”项下色谱条件，分别进样20μL，测定青藤碱峰面积。以峰面积积分值（Y）对进样浓度（X）进行回归，得回归方程为Y＝2404.67X+17.84（r＝0.9999，n＝5）。结果表明，青藤碱进样量在2.5～22.5μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.1.5 含量测定 分别取供试品和对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，注入HPLC仪，按上述色谱条件测定，计算青藤碱含量。

2.2 乙醇不同提取方法优选

现代药理实验表明，青藤碱为青风藤药材的主要有效成分。但对其有效成分提取工艺的研究报道不多。笔者在参考有关文献[3]的基础上，以乙醇为溶剂采用浸渍法、连续渗漉法、回流法对药材进行提取工艺优选。每种提取方法中乙醇浓度分别设为95%、85%、75%、75%（pH 8～9）和65%（pH 8～9），共5个水平，乙醇用量约为药材量的12倍。不同提取方法比较结果见表1。

表1 不同提取方法比较结果Tab 1 Results of different extraction methods

由表1可知，以青藤碱含量为指标，在提取方法相同的条件下，乙醇浓度越大青藤碱含量越高；在溶剂相同的条件下，连续渗漉法较浸渍法好，而与回流法接近；加碱的乙醇可较大提高青藤碱的含量。考虑到减少杂质、降低能耗、操作简便等因素，同时尽可能获得较高的含量等，本工艺采用乙醇连续渗漉法提取。

2.3 乙醇连续渗漉提取工艺参数优化

在确定选用乙醇连续渗漉提取青风藤的工艺后，还要考虑渗漉条件对青藤碱含量的影响。影响因素有乙醇浓度（A）、乙醇用量（B）、药材粒度（C）、pH值（D）及渗漉速度等[4]。《中国药典》将渗漉速度分为慢渗和快渗两种，慢渗为1～3mL·kg-l·min-l，快渗为3～5mL·kg-l·min-l。本次属小型试验，若渗漉速度过快，则有效成分可能来不及浸出和扩散，从而导致青藤碱含量低，故统一控制渗漉速度为1～3mL·kg-l·min-l。前4个影响因素中每个因素选3个水平，选用L9（34）正交表进行试验。因素水平见表2。

2.4 正交试验结果与分析

精密吸取供试品溶液10μL，按上述色谱条件测定，以外标法计算青藤碱含量。正交试验结果见表3；方差分析结果见表4。

表3 正交试验结果Tab 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析结果Tab 4 Results of variance analysis

由表3、表4可知，因素A、B、D对试验有显著性影响（P＜0.01），因素C对试验结果无显著影响，各因素对青藤碱含量影响大小的顺序为D＞A＞B＞C。由于因素C影响较小，可任意取一水平，结合生产实际和节省能源角度考虑，拟选取C1，以因素C作为误差估计，最佳提取工艺为A3B3C1D2，即药材粉碎过10目筛，以12倍量75%乙醇（用氨水调节pH 8～9）连续渗漉提取。

2.5 验证试验

取3批处方量青风藤药材，按上述最佳提取工艺进行试验。结果表明，青藤碱的平均含量为（7.04±0.03）mg·g-l，与正交试验得到的青藤碱最高含量相当，故该工艺可作为青风藤的提取工艺。

3 讨论

从青藤碱结构特点可以判断其呈弱碱性，为提高青藤碱的含量，故在提取工艺比较中选用碱化乙醇。有文献报道[5]采用石灰碱化法调pH值，考虑到随着石灰用量的增加将导致产品含钙量超标的可能性，本试验采用氨水调pH值，用量控制在0.7%即可保证pH值在8～9的范围。

本试验分别采用不同浓度的乙醇提取青藤碱。结果表明，高浓度乙醇的提取物含较多树脂等极性小的化合物，难以干燥，而低浓度乙醇的提取物含树脂等极性小的化合物较少，容易干燥，但乙醇的浓度太低，提取率低，溶剂回收困难。结果显示，65%～75%中等浓度乙醇有较高的提取率，也容易回收溶剂。

青藤碱的检测方法是在参考文献[6]和《中国药典》试验方法的基础上以不同条件摸索改进而成，得到的峰形好、保留时间短，分离效果好。

[1]张爱丽，潘卫东.补肾健骨片水煎药材的提取、纯化及制剂工艺研究[J].淮海工学院学报（自然科学版），2007，16（4）:42.

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京:中国医药科技出版社，2010:181.

[3]宋永彬，程维明，曲戈霞，等.青风藤化学成分的分离与鉴定[J].沈阳药科大学学报，2007，24（2）:79.

[4]王桂蓉，黄 涛.延生口服液提取工艺的研究[J].中国药房，2001，12（8）:456.

[5]王晓玲，温普红，冯列梅.青藤碱提取工艺的优化[J].中草药，2001，32（8）:702.

[6]张义生，袁小艳，张荒生，等.高效液相色谱法测定痹痛定胶囊中青风藤的含量[J].中国药房，2007，18（9）:208.